Осп 9 мм вес: Сколько весит лист осб 9 мм 1250х2500. ОСБ плиты для пола – все о характеристиках, видах и применении для отделки пола

Содержание

Сколько весит лист осп 9 мм


Вес ОСБ плиты

В указанных таблицах приведена ориентировочная информация по весу листа и пачки OSB в зависимости от размеров и толщины ОСБ.

Вес ОСБ рассчитан исходя из средней плотности — 650 кг/м3.

Номинальная толщина ОСБ, ммРазмеры ОСБ плиты
2440х1220 мм2500х1250 мм
Листов в пачкеВес листа, кгВес пачки, кгЛистов в пачкеВес листа, кгВес пачки, кг
614011,6162514012,21705
99217,416009218,31680
9,58318,415258319,31600
117021,314907022,31565
126423,214856424,41560
15542915705430,51645
184734,816404736,61720
224042,617004044,71790

Технические характеристики различных марок фанеры.

Подбор нужного вида фанеры для различных работ.

Описание процесса лазерной резки фанеры

Технология укладки фанеры на деревянный пол

Выбираем правильную марку фанеры по различным критериям.

Выбор и использование фанеры для опалубки.

Параметры веса и плотности ДСП в зависимости от толщины листов

Вес и плотность листов ОСБ.

Особенности работы с мебельной фанерой.

Описание технологии производства прессованной фанеры

Рассматриваются особенности применения транспортной фанеры

Разновидности гибкой фанеры и их применение.

Подробное описание и рекомендации укладки фанеры на пол под линолеум.

Монтаж и установка полок из фанеры.

Гнутая фанера. Технологии и методы изгиба фанеры.

Авиационная фанера. Использование, производство и маркировка авиационной фанеры.

Декоративная фанера. Подробное описание и виды декоративной фанеры.

Строительная фанера — описание материала. Характеристика строительной фанеры.

Стоимость фанеры в зависимости от ее характеристик. Выбор оптимальной фанеры для проведения определенных работ.

Вес фанеры различной толщины. Плотность березовой и хвойной фанеры.

1 | 2

mosfanera.ru

Сколько весит плита OSB толщиной 9 мм?

Ориентированно-стружечная плита, сокращенно именуемая ОСП или OSB (от англ. oriented strand board), разработана для скоростного возведения и отделки зданий жилого, хозяйственного и коммерческого назначения. Лист выпускается в различных габаритах, что существенно сказывается на таких его характеристиках как вес и области применения.

Особенности ОСП

Стружечная плита OSB выпускается из крупнофракционной стружки технической древесины. Чаще всего используются тонко наструганные отходы хвойных пород дерева. Толщина щепы не должна превышать 1 мм, допустимая длина – до 20 см. Весит она, конечно, немного, но в массе и в сочетании с другими компонентами получается немало.

На производстве сырье перемешивается с термореактивными смолами и проходит этапы формования, прессования, сушки и нарезки. При этом применяется технология послойной укладки, благодаря чему получается разнонаправленная ориентированность стружки в каждом слое. Такое сочетание увеличивает прочность OSB и повышает устойчивость к атмосферным перепадам, включая температуру, влажность и так далее.

OSB выпускается в 3 основных форматах:

  • 2,44х1,22 м – традиционные габариты, удобные в ремонте и строительстве;
  • 2,5х1,25 м – наиболее часто встречающийся формат категории ЕВРО;
  • 2,44х0,59 м – размер для шпунтованной продукции (плита с пазогребневой системой соединения).

А вот по толщине предложений больше – от 6 до 40 мм. Наиболее востребованы OSB сечением от 9 до 14. Именно в этом размере изделия имеют оптимальные характеристики для применения в стандартных конструкциях, таких как перегородки, потолки, стены, каркасные постройки и др.

От габаритов зависит, сколько весит лист ОСБ 9мм. При разработке проекта здания важно учитывать этот параметр, так как при расчетах закладывается допустимая нагрузка на фундамент и грунт, перекрытия и тому подобное. При внутренней отделке знание таких параметров как вес и размеры позволяет заранее определиться с количеством помощников.

Вес ОСБ 9 мм в среднем составляет 18 кг. Если требуется одна плита OSB – это немного, но для опалубки или фасадной отделки потребуется не менее 1 полного поддона, в котором содержится как минимум 96 изделий. Получается, что необходимое количество весит чуть больше 1,7 тонн. Любому ясно, что одному человеку не под силу поднять такой вес. Понадобится либо много помощников, либо специальная техника для выгрузки и транспортировки.

Области применения

Стружечная плита OSB в 9-миллиметровой толщине не отвечает требованиям, предъявляемым к несущим конструкциям, поэтому используется в следующих работах:

1. Для подшивания потолков и экономичного выравнивания стен.

2. При возведении перегородок.

3. В сухой стяжке пола, но не в один лист, а в два. Причем слои должны укладываться с перехлестом швов.

4. Для подшивки подкровельного пространства. Но плита OSB должна быть обязательно влагостойкой.

5. При монтаже стендов, прилавков и других аналогичных изделий. Желательно заранее выбрать лист определенных габаритов и построить план выкраивания, чтобы уменьшить количество отходов.

6. Для возведения хозяйственных построек или небольшого сезонного жилья. В данном случае плита OSB толщиной 9 мм – это экономный, но недолговечный вариант.

elbruso.ru

ОСБ плита вес 9 мм

Зная сколько весит осб плита 9 мм можно правильно рассчитать количество профилей, реек на каркас под ее монтаж, общий вес конструкции, ее возможности. Такого рода материал широко применяется в строительстве, ремонте. Используя osb плиты можно быстрее и проще выполнять отделку жилых и коммерческих, промышленных и многих других помещений. Они безвредные для людей и окружающей среды. На них всегда есть сертификаты, как и на плиты 2П-30-18-30.

Особенности плит 9 мм

Если необходима осб плита вес 9 мм изделия будет зависеть от его размеров. Лист стандартной формы будет весить примерно 18 килограмм. Его чаще всего принято использовать для подшивки потолка и стен, при возведении перегородок и полов, для этого нужно стелить два слоя изделия. Из нее делаются стенды и прилавки, легкие ни несущие и не ответственные конструкции.

Если нужна плита осб 9 мм цена на нее приятно удивит, она составляет примерно восемь долларов. Площадь листа достигает 3,125 метров квадратных, ее стандартный размер 2,5 на 1 метр 250 миллиметров, что очень удобно, потому что большинство помещений имеет высоту такую же как плита длину. Цена на изделие зависит и от компании производителя и от плотности. Узнав сколько стоит осб плита 9 мм проще будет рассчитать необходимое на ее покупку количество денег. Изделие легко поддается раскрою при помощи лобзика. Монтируют ее используя саморезы и шуруповерт.

В производстве качественных плит применяют лесоматериалы только высокого качества, обычно это ель или сосна, исключают при этом использование древесных отходов. Технологический процесс можно поделить на два основных этапа, первый заключается в лущении бревна на щепу, а второй в прессовании под давлением, при температуре в двести градусов. В таких условиях происходит полимеризация связующих веществ и плита приобретает отличные характеристики, ее верхний слой становится глянцевым и очень крепким, устойчивым к повреждениям.

Листы OSB 9 миллиметров отличаются хорошими водоотталкивающими свойствами. Они могут находиться в воде до суток и при этом станут влажными всего на 12%. В их производстве применяют специальные вещества, эмульсию воска, которая наделяет лист лучшими свойствами. Он будет противостоять образованию плесени и грибков, воздействию насекомых. Поэтому его можно использовать сразу после покупки, не подвергая дополнительной обработке, окрашиванию, грунтовке, что очень выгодно экономически.

Плиты бывают повышенной влагостойкости, невлагостойкие и влагостойкие. По длине листы могут производиться на тридцать сантиметров больше от стандарта и достигать 2 800 миллиметров. По плотности они обычно соответствуют показателю в 650 кг/кбм. Все необходимые характеристики плиты OSB 9 миллиметров можно узнать у продавца или производителя. Такие современные строительные материалы гарантируют быстрое, более легкое строительство, ремонт и рациональное использование средств.

www.motti.ru

Плита ОСБ — размеры, характеристики, свойства и назначение.

Плита ОСБ изготавливаются из крупной древесной стружки (щепки могут достигать 18 см в длину, а ширина их колеблется от 6 мм до 4 см). В качестве связующего материала используется специальная смола (в составе которой присутствует мочевина, формальдегиды и фенол). Водостойкость готового изделия достигается за счет примеси во время производства синтетического воска. Помимо этого, в состав добавляется и соль кислоты борной.

Особая стойкость и жесткость обеспечивается технологией производства, которая основана на разнонаправленности укладываемых слоев сырья. Подразумевается, что внешние слои укладываются так, чтобы стружка ложилась вдоль готового листа. А внутренние слои укладываются таким образом, чтобы стружка ложилась поперек полотна.

Все элементы связываются между собой посредством горячего прессования. Благодаря всем этим нюансам производства данный материал получает ряд преимуществ перед другими видами подобных плит. ОСБ плита свойства, характеристики и размеры.

Плита ОСБ размеры: технические характеристики

Толщина листа может колебаться от 8 мм до 25 мм. Условно плиты можно разделить на три группы.

  1. Первая группа (тонкие полотна) – 8, 9 и 10 мм, ОСБ плита вес — 16.6 кг, 18.4 кг и 20.6 кг соответственно.
  2. Вторая группа (средней толщины полотна) – 12 и 15 мм, ОСБ плита вес — 24.1 кг и 30 кг.
  3. Третья группа (толстые полотна) – 18, 22 и 25 мм, OSB плита вес — 35.3 кг, 43.1 кг и 48.8 кг.

Размер плиты ОСБ:

  • 2440х1220 мм. один из самый популярный размер плиты осб, наиболее часто применяем в строительстве;
  • 2500х1250 мм. данный размер плиты осб, как правило, имеют более дешевые европейские аналоги;
  • 2440 х 590 мм. довольно редкий размер плиты осб со шпунтованными краями, обычно используется при создании основания полов.

Приобретая материал не поштучно, а паллетами, следует учесть, что чем тоньше полотно, тем больше штук будет на нем. Так 8-ми миллиметровых полотен поместится 120 штук, а 25-ти миллиметровых – всего 38 штук.

Виды материала: плита ОСБ

Разделение данного материала на виды осуществляется по таким параметрам как прочность и влагостойкость. Исходя из них, выделяются следующие варианты:

ОСБ-1

Данный вид имеет самые низкие показатели противостояния к воздействию влаги, а также механическим нагрузкам. Наиболее всего пригоден для производства элементов меблировки, а также для использования в качестве материала для упаковки и транспортировки.

ОСБ-2

Этот вид имеет все те же невысокие показатели противостояния к влаге, зато обладает более высокой механической прочностью. Наиболее часто используется в процессе изготовления несущих конструкций (балки перекрытия).

ОСБ-3

Этот вид наделен не только достаточной прочностью, но и хорошими показателями влагостойкости. Поэтому его используют точно также как и предыдущий вид, только с возможностью установки в местах с высокими показателями влажности.

ОСБ-4

Данный вид материала наделен самыми высокими показателями всех вышеназванных свойств. Именно поэтому вариантов его эксплуатации множество. Может быть использован в ситуациях с самыми жесткими условиями и требованиями.

Плита ОСБ: преимущества

  • Не расслаивается и не крошится.
  • Обладает однородной структурой.
  • Ценовая доступность.
  • Абсолютная безвредность в экологическом плане.
  • Готовые элементы обладают более высокими показателями упругости и гибкости (в сравнении с кирпичной или каменной кладкой).
  • Не разрушаются под воздействием резких перепадов температур.
  • Легки в плане обработки и отделки.
  • Своеобразная структура позволяет намного жестче фиксировать металлические элементы в полотне (гвозди, саморезы и прочее).
  • Есть возможность использования варианта соединения вида «паз-гребень».

Недостатки

  • При использовании полотен внутри помещения обязателен момент с внешней отделкой полотен (для обеспечения эстетичного внешнего вида).
  • Во время распила обязательно использование респираторов. Связано это с присутствием в составе вредных для дыхательных путей смол.

 Область применения плит OSB (ОСБ)

Как таковых областей и вариантов использования насчитывается огромное множество. Перечислим самые распространенные.

  1. Обрешетка при устройстве кровли.
  2. Используется плита ОСП для пола, а именно для его быстрого выравнивания под укладку паркета или ламината.
  3. Монтирование опалубки.
  4. Монтаж перегородок внутри помещений.
  5. Обшивка фасадов зданий.
  6. Используется в качестве конструктивных элементов, во время возведения зданий в один или два этажа.
  7. Для производства СИП панели.
  8. Сооружение прилавков, стендов и прочего.
  9. Устилание полов внутри автомобильного транспорта, предназначенного для перевозки грузов.
  10. Используется для возведения сезонного жилья или нежилых помещений (летние дачи, гаражи, рабочие пристройки).

Информация на заметку: Модульные дома для круглогодичного проживания, Каркасные дома по низким ценам

 

stroitelinfo.ru

Сколько весит осб 3 плита 9 мм. ОСБ плита вес 9 мм

[REQ_ERR: SSL] [KTrafficClient] Something is wrong. Enable debug mode to see the reason.

Если их используют только для облицовки, и они не будут нести физической нагрузки, то выбор должен пасть на тонкие варианты исполнения.

Вес зависит от толщины и должен также учитыватся. Деление происходит на основе влагостойкости и механических свойств. Это позволит вам с первого взгляда определится с выбором подходящей категории для панелей. Чем выше категория, тем более устойчивы панели к воздействию влаги и физической нагрузки. Различают четыре категории:. Размер панелей ОСБ обычно указывается в миллиметрах. Данные относятся к длине и ширине. Обратите внимание на то, что в продаже есть модели как с прямыми краями, так с пазом и замком.

Они часто используются при укладке на пол и имеют крепкое соединение между собой, подробнее о укладке ОСБ читайте тут. Чтобы уменьшить длину швов между отдельными плитами, при облицовке стен следует выбирать плиты как можно большего размера.

Промежуточные швы представляют собой слабые места, которые, например, могут привести к смещениям и деформациям. Если вы планируете оштукатуривать плиты, то работа с плитами больших размеров будет проще. Переходы могут привести к образованию трещин в штукатурке, из-за чего стыки должны обрабатываться отдельно.

Тем не менее, панели еще и имеют собственный вес, что, в свою очередь, является преимуществом в вашем случае если вы выберите тонкие варианты исполнения ОСБ, они легче в обращении за счет небольшого веса. При отделке внутри помещения вы можете также работать с панелями разных размеров — чтобы было меньше отходов, главное чтобы толщины были одинаковые. Совет: при указании толщины и размера панели допустимы определенные диапазоны точности. Покупая панели от одного производителя вы снижаете риск получить такое неудобство.

Плиты служат также и для изоляции помещения, могут нести значительные нагрузки.

Чем толще материал, тем лучше изоляционные свойства и свойства прочности. Также для этих целей, по возможности не следует укладывать плиты больших размеров, так как это может привести к деформации или смещению из-за перепадов температур и влажности.

Плиты ОСБ изготавливаются из отдельных стружек, которые прессуются. Температура прессования составляет от до градусов. Этот материал создают из древесной стружки, которая скреплена с применением смоляных клеевых составов, сформирована в виде плит.

Главной особенностью является специальная ориентация щепок в изделиях. Она позволяет получить технические характеристики , необходимые для разных видов последующего применения. Проще выяснить, что такое плиты ОСП, сравнив их с аналогичными изделиями. На рисунках хорошо видны различия материалов. Чтобы примерно оценить их, надо отметить, что по прочности ОСП приближается к , хотя стоит дешевле.

Самыми низкими техническими характеристиками обладает.

Для удобства сравнительного анализа пригодится следующая таблица. Здесь приведены данные по пределам прочности в МПа для разных плит толщиной от 9 мм до 12 мм.

В столбцах указаны виды лабораторных испытаний с учетом способа приложения сил. Сведения из таблицы пригодны только для приблизительного сравнительного анализа. Чтобы выяснить, подходит ли для проекта ОСП плита, размеры и цены, другие характеристики берут из сопроводительной документации производителя на соответствующее изделие. От качественного подбора необходимых стройматериалов напрямую зависит тепловая устойчивость вашего дома, ведь ошибившись, в первоначальных расчётах вы рискуете сделать утепление здания неполноценным.

В помощь вам предоставляется подробная таблица теплопроводности строительных материалов, описанная в этой статье. Надо выяснить, возникнет ли вред для здоровья, если OSB плита установлена внутри помещения. Также пригодятся знания о том, какие виды изделий этого класса существуют в настоящее время. Современное производство отличается высоким уровнем автоматизации. Небольшое количество персонала позволяет сокращать лишние расходы. Новые, хорошо оснащенные предприятия обеспечивают высокое качество в каждой товарной партии и разумную себестоимость готовой продукции.

В статье рассмотрим что из себя представляет плита МДФ, как и где используется. Стандарты размеров и толщины листа, приблизитальная стоимость и секреты правильного монтажа стеновых панелей.

Для упрощения выбора предлагается следующая система распределения групп изделий, которая создана на принципах целевого назначения. Ниже перечислены основные отличия разных классов:. К сведению! По статистике специалисты предпочитают использовать плиты ОСП 3 с характеристиками универсального типа.

Они пригодны для внутренних и наружных работ, а стоимость — вполне разумна. В некоторых клеевых составах применяют фенол-формальдегидные компоненты. С их помощью повышают стойкость древесины к влаге, биологическим поражениям. Если предполагается установка плит внутри помещений, лучше исключить подобные составляющие.

При испарении они ухудшат здоровое состояние атмосферы в комнате. Технические характеристики ОСБ плит, размеры и цены предполагают широкую сферу использования этих универсальных материалов. Прочности хватит даже в процессе изготовления крупных конструкций.

Особенности плит 9 мм

При необходимости как на рисунке отдельные места укрепляют с помощью распорок. Из приведенных данных понятно, что размеры и цены OSB плит предлагаются торговыми предприятиями разные. Не везде покупателям предоставляют полные данные об изделии, иногда отсутствует название производителя, иные важные сведения.

Чтобы не совершать ошибок, надо применить сравнение по единой форме, с установленными заранее критериями. Если необходимо — сделайте письменный запрос в магазин о дополнительных параметрах. Пол из ОСБ сейчас пользуется огромной популярностью. Он обладает большим количеством преимуществ и дает возможность сократить срок проведения ремонта. ОСП — это сильно спрессованная плита, которая состоит из нескольких слоев. Сырьем для производства этого материала являются длинные щепы по см , получаемые из хвойных древесных пород сосны, иногда — осины.

Прочность ОСП обеспечивается различной ориентацией щепы. Толщина, мм: 9.

СП OSB-3 ОСБ шлифованные плиты Kronospan Кроношпан, Чехия Назначение плит OSB ОСП ОСБ Kronospan: — для кровли основа под битумную черепицу или другие покрытия ; — для обшивки стен, крыш и потолков; — для черновых и мозаичных полов; — для заборов и временных ограждений; — в качестве перегородок и срезающие стен; — как декоративная обивка стен; — для мебельных каркасов и рекламных щитов; — как заменитель пиломатериалов и фанеры; — в качестве полок и складских стеллажей; — из ОСП изготавливают поддоны, ящики и упаковку; — применяют как опалубку многоразового использования.

Похожие товары:. Их размер позволяет перекрывать ровным слоем значительную по размерам площадь, обходясь при этом без больших затрат. Внешняя отделка на плиты выполняется практически сразу. Плиты ОСБ являются продукцией, аналогичной популярному еще совсем недавно ДСП, и обладают многими схожими характеристиками. Однако при производстве плит ОСБ применяются особые технологии, предполагающие использование определенного размера и вида щепы древесной.

Кроме того, получить дополнительные преимущества позволяет и способ укладки щепы, который осуществляется в три перпендикулярных взаимно слоя. Плиты ОСБ подразделяются на четыре основных вида, зависит это от эксплуатационных свойств, определяемых способом их производства и сырьем. Каждый вид обозначается буквами OSB и характерным для этого вида номером. Более востребованными среди прочих являются плиты OSB Они обладают достаточно высокой влагоустойчивостью и широко распространены и популярны среди потребителей.

Они производятся различными по размеру, ширине, длине и толщине.

Ориентированно-стружечная плита ОСП, ОСБ, OSB — сокращение от английского выражения oriented strand board является современным конструкционно-отделочным материалом, который применяют для различных работ. ОСБ задумывалось как недорогая альтернатива фанере и ДСП , ведь возможность использовать для изготовления стружки неделовую древесину снижает стоимость готовой продукции. Размеры деревянной стружки для ОСБ составляют 1—20 см в длину и 1—50 мм в ширину. Подробнее о том, как производят стружку, можете прочесть здесь.

Существует также разделение выпускаемых плит на варианты американские и европейские. Каждый из видов отличается традиционными способами обработки и размерами.

Сколько весит плита osb 3. Размеры ОСБ плит. Преимущества OSB плит

Такое распределение сложилось вследствие того, что впервые стружечные плиты были созданы в странах Северной Америки, лишь только позднее они появились в нашей стране. Кроме того существуют нестандартные виды плит ОСБ, они не относятся к наиболее ходовым. В их числе плиты австрийского производителя Kronospan, который выпускает плиты, имеющие размер х мм, еще один производитель — бельгийская фирма Norbord NV, выпускающая листы х мм.

Хотелось несколько слов сказать еще об одном параметре плит ОСБ — толщине. Зачастую потребителю предлагаются плиты, имеющие толщину мм. Плиты ведущих производителей определены строгими стандартами на допускаемые отклонения.

К примеру, американскими стандартами CSA и CSA определяются минимальные допуски по толщине 0,3 мм, допуски по линейным стандартам — не больше 3 мм. При проведении монтажа поверхностей большой площади это позволяет исключить неровности и зазоры. Как правило, плиты предлагаются покупатели либо поштучно, если партия небольшая, либо пачками. Причем при покупке плит от одной пачки скажется на снижении стоимости материала. Именно поэтому, приобретая плиты, целесообразно будет выбрать нужные толщину и размер.

А для этого необходимо знать, как происходит упаковка плит изготовителем для отправки в магазины. В целом количество плит в пачке и ее вес зависят от технологических особенностей, линейных размеров плит и их толщины. Эти показатели указывают на то, что плиты имеют наиболее ходовые размеры, а также имеют все, который позволяет не только их легко перемещать вручную, но и работать с ними на высоте при монтаже кровельных поверхностей и верхних перекрытий.

Рассмотренные выше свойства плит ОСБ объясняют все более и более растущую популярность материала, его широкое применение при возведении конструкций и загородных домов. Данный стройматериал на основе древесины специально создавался для целевого применения — в сфере строительства. Благодаря тому, что преимуществ у плит OSB множество, а минусов практически нет, они пользуются повышенным спросом, особенно в частном секторе.

Зная размеры и примерную стоимость OSB плиты, несложно определить потребное количество образцов и оптимизировать свои расходы на их приобретение. OSB имеют множество отличий от других разновидностей плитных и листовых материалов.

Структура образцов, технология их изготовления, целесообразность применения в том или ином случае и ряд иных вопросов — это отдельные темы. В плане размеров интереснее одно из требований ГОСТ.

МЫ РЕКОМЕНДУЕМ

В частности, в ней отмечены только минимальные значения линейных параметров, а относительно их верхнего предела ничего не сказано. Есть и оговорка, характерная для ГОСТ с ТУ на иные листы и плиты — производитель имеет право выпускать OSB по согласованию сторон и других размеров, отличных от стандартных значений. Получается, что все табличные данные — ориентировочные. Следовательно, любая плита, какие бы размеры она не имела, изготовлена без нарушения соответствующих положений ГОСТ.

Прежде чем заниматься планированием строительных ремонтных работ, составлением схем и расчетами потребного количества изделий, стоит внимательно изучить сортамент OSB на местном рынке и буквально подстраиваться под него.

Лист выпускается в различных габаритах, что существенно сказывается на таких его характеристиках как вес и области применения. Чаще всего используются тонко наструганные отходы хвойных пород дерева. Толщина щепы не должна превышать 1 мм, допустимая длина — до 20 см. Весит она, конечно, немного, но в массе и в сочетании с другими компонентами получается немало.

То, что производитель имеет право сам определять их линейные параметры, еще не означает, что выбор достаточно большой. Любая компания ориентируется не в последнюю очередь на спрос.

Что в основном предлагает рынок? При определении целесообразности использования OSB в каждом конкретном случае нужно ориентироваться на оптимальное сочетание прочности конструкции с ее весом.

СКЛАД — г. Воскресенск, СКЛАД — д. Грибки

Это означает, в первую очередь, грамотный расчет толщины плиты, а не ее размеров. Стоимость OSB зависит от нескольких факторов: группа по устойчивости к влаге , размеры образца, толщина, производитель, регион продажи то есть транспортная надбавка. Желательно приобретать продукцию от известных, с хорошей репутацией компаний. Это означает, что несоответствие от заявленных размеров минимальные.

Первая российская плита Калевала ОСП 3 имеет светлый тон и прекрасна как для черновых строительных работ, так и для отделочных чистовых работ. Она крепкая и стойкая к перегрузкам, используется в каркасном домостроении и имеет хорошее соотношение цена ОСП 3 качество.

Следовательно, в процессе монтажа плит не возникнет проблем с их стыковкой, образующимися значительными зазорами и так далее.

Даже если такая продукция и стоит несколько дороже, потом не придется тратить время и деньги к примеру, на герметики или мастики. Из отходов деревообработки производят различные изделия, которые широко используются в строительстве, ремонте, упаковке и других сферах. Один из таких материалов — ориентированно-стружечные плиты ОСП.

Рассмотрим характеристики и стоимость продукции. Более крупная стружка используется в так называемых ориентированно-стружечных плитах. Изделие представляет собой многослойный лист, состоящий из смеси:.

Количество слоев в ОСБ — от 3 и более зависит от толщины готовой продукции. Расположение строго ориентированное в продольном или поперечном направлении. Благодаря тому, что все слои разнонаправлены, то есть каждый пласт перпендикулярен относительно следующего, плита получается весьма прочной и стабильной к изменению линейных размеров. Особенно это важно для регионов с повышенной сейсмической опасностью или высоким уровнем влажности воздуха.

Это прибрежные и горные районы, островные территории и тому подобное. Как видно из таблицы, габариты в основном варьируются по такому показателю как толщина листа.

Вес ОСБ плиты

Ширина и длина выбраны как оптимальные для различных сборных конструкций. В качестве определяющего фактора в данном случае выступает минимальное количество отходов.

Отечественные производители предлагают крупным клиентам услугу — выпуск в нужном формате. Предварительно технолог просчитывает, как повлияют новые размеры ОСБ на прочностные характеристики продукции, только после этого заказ поступает в исполнение. Толщина OSB влияет на выбор области применения.

Размеры панелей ОСБ

К примеру, тонкая плита 6 мм подходит для упаковки или обшивки потолка. А для напольных конструкций лучше выбирать ОСБ сечением от 9 и более. ОСБ-2 — лист используется для ненесущих систем в помещениях с нормальной или пониженной влажностью;. ОСБ-3 — несущая плита повышенной влагостойкости, предназначенная для эксплуатации при высоком влажностном режиме. Толщина начинается от 8 мм;.

ЛОСП — ламинированная продукция, покрытая специальными пленками. В этой категории можно выделить изделия:.

ОСП-ш — лист с пазогребневой системой соединения шип-паз , иначе называется шпунтованным. Размер ограничен из-за относительной хрупкости торцевых выступов: ширина — , ширина — до , толщина — мм;. Ассортиментный ряд, стоимость и размер для каждого выпускаемого вида ОСБ заводы определяют для себя самостоятельно. К примеру, несложный обзор показывает, что компания Kronospan сосредоточилась на выпуске узкоспециализированной, но не слишком дорогой продукции, тогда как концерн Egger больше упирает на универсальные разновидности, доступные для большинства покупателей.

В одном едины — каждая плита маркируется строго в соответствии с европейскими нормативами DIN. Как свидетельствуют отзывы, ОСБ нельзя назвать пожаробезопасными, презентабельными и биостойкими. Однако все недостатки с лихвой окупаются солидным количеством плюсов. Возведения опалубки. Для этого желательно выбирать ламинированный вариант, что гарантирует прочность и устойчивость к бетонной смеси.

Обшивки наружных стен в каркасном или традиционном строительстве под финишную отделку.

Плита OSB-3 (ОСП) 2500х1250х9 мм

Описание товара

OSB-Ориентированно-стружечная плита (ОСП, OSB(ОСБ) — oriented strand board) — конструкционный листовой строительно-отделочный материал, изготовленный из тонкой древесной щепы и водостойкой синтетической смолы. Плита состоит из нескольких слоев, которые имеют различную ориентацию (во внутренних поперечную, в наружных продольную). Такая структура позволяет достигать высоких показателей прочности. Готовые конструкции из ОСП имеют малый вес, но при этом они выдерживают большие нагрузки.

Плиты OSB имеют хорошие эксплуатационные характеристики, они устойчивы к температурным и влажностным перепадам, отличаются стойкостью к расслоению и набуханию. ОСП прекрасно обрабатывается любым инструментом для работы по дереву и имеет более низкую стоимость по сравнению с другими конструкционными материалами. Специалисты возлагают на ОСП большие надежды и предсказывают великое будущее. Производство ориентированно-стружечных композитных материалов считается к одним из наиболее перспективных направлений.

Свойства и технические характеристики ОСП 

  • Стандартные размеры листа:  2500х1250мм;
  • Толщина листа:  9 мм;
  • Содержание влаги: менее 13%;
  • Плотность материала: 640-700 кг/м3;
  • Предел прочности на изгиб продольный: не менее 29 МПа;
  • Предел прочности на поперечный изгиб: не менее 12,4 МПа;
  • Разбухание в толщину после 24-часового замачивания: не более 15%;
  • Гвоздеудерживающая способность: высокая;
  • Окрашиваемость: плита может быть окрашена любыми лакокрасочными материалами, рекомендуемыми для дерева;
  • Склеиваемость: OSB склеиваются любыми клеевыми составами, рекомендуемым для дерева;
  • Механическая удерживающая способность: очень высокая;
  • Огнестойкость: плиты ОСП относятся к группе горючести Г4

 

Риски и преимущества

Issue Brief (Commonw Fund). Авторская рукопись; доступно в PMC 2015 8 октября.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

Issue Brief (Commonw Fund). 2003 Apr; (620): 1–9.

PMCID: PMC4598063

NIHMSID: NIHMS725935

Школа государственного управления им. Джона Ф. Кеннеди

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, обращайтесь: Мэри Мэхон, Public Сотрудник по информации, Фонд Содружества, One East 75th Street, New York, NY 10021-2692, тел. 212.606.3853, факс 212.606.3500, gro.fwmc@mm

Introduction

Представители здравоохранения давно опасаются применения биологического оружия против Население США, но после 11 сентября и атак сибирской язвы подготовка к возможность биотерроризма приобрела большую актуальность. Оспа считается одной из наиболее опасного потенциального биологического оружия, потому что оно легко передается, немногие люди обладают полным иммунитетом к вирусу, и нет эффективного лекарства. Ликвидация оспы во всем мире с помощью программ вакцинации была объявлена Всемирная организация здравоохранения в 1980 г., практически исключив возможность «Естественная» вспышка. 1 Официально небольшие количества вируса оспы существуют в безопасных и авторизованные предприятия в США и России. 2,3 Недавние новостные сообщения связывают возможности оружия против оспы с Ираком и Афганистан. 4 В настоящее время, Государственный департамент и Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) рассматривают вероятность приступа оспы должна быть низкой. Однако достоверность этого Угроза может измениться с появлением новых сведений и быстро развивающихся мировых событий.

С 2001 года американские ученые, политики и общественность обсуждают следует ли предлагать вакцинацию против оспы американцам в рамках подготовки к приступ оспы. 13 декабря 2002 г. администрация Буша объявила, что начнется вакцинация примерно одного миллиона военнослужащих и специалистов общественного здравоохранения в январе 2003 г. Будет предложена добровольная вакцинация для населения, начиная с 2004 г., хотя лица, желающие пройти вакцинацию ранее может иметь доступ к вакцине. 5 По данным Общественной школы Роберта Вуда Джонсона / Гарвардского университета. Опрос здоровья о реакции Америки на биологический терроризм, проведенный в Осенью 2002 г. обеспокоенность населения угрозой оспы относительно высока. 6 Большинство респондентов (64 процентов) заявили, что, по их мнению, нападение террористов, зараженных оспой, может вероятно, если Соединенные Штаты предпримут военные действия против Ирака. Восемьдесят один процент респондентов высказались за добровольную вакцинацию врачей и медсестер в подготовка к нападению.Почти две трети высказались за то, чтобы лечить оспу. вакцина для населения теперь на добровольной основе. Шестьдесят один процент сказали, что они бы выбрали вакцинацию, если бы она была предложена в качестве меры предосторожности против биотеррористическая угроза. Если бы в Соединенных Штатах были случаи оспы, 75 процент респондентов предпочли бы пройти вакцинацию.

Предпосылки: инфекция оспы

Оспа вызывается вирусами натуральной оспы, входящими в состав ортопокс-вируса. семья. Вирус имеет две основные формы: натуральная оспа и натуральная оспа. незначительный. 7 Исторически сложилось так, Основные эпидемии натуральной оспы обычно приводили к смертности от 30 процентов и выше. среди непривитых, тогда как летальность от Variola small составляла 1 процент или меньше. Оспа распространяется в основном по воздуху, через нос и рот инфицированного человека. человека, и при прямом контакте. Загрязненная одежда и постельное белье также могут распространяться болезнь. 8 Вирус выживает легче всего в прохладных и сухих условиях. Следовательно, инфекция оспы распространяется быстрее всего зимой и ранней весной.

Вирус первоначально поражает иммунную и респираторную системы, где он умножается и распространяется. Вторичная инфекция начинается примерно на восьмой день, когда вирус концентрируется в мелких кровеносных сосудах на коже и под ртом и горло. В конце 12-14-дневного инкубационного периода пациент обычно испытывает сильную лихорадку и недомогание. В это время появляется выпуклая луковичная сыпь, сначала во рту и в горле, затем на лице и предплечьях появляется сыпь, тело и ноги.В течение двух-четырех дней сыпь становится приподнятой и наполняется жидкий и глубоко укоренившийся в коже. Поражения во рту и горле быстро открываются, выброс вируса в слюну и выдыхаемый воздух — основной источник инфекции другим. Пациенты обычно наиболее заразны в течение первых трех-десяти дней сыпь. В нефатальных случаях по мере выздоровления пациента из пузырьков образуются струпья, отделяются, и образуются ямчатые рубцы, наиболее заметные на лице. По мере образования корок инфекция быстро угасает.

Простота диагностики оспы

Быстрое обнаружение — ключевой компонент ответа на атаку оспы. Проблемы с быстрой и эффективной диагностикой оспы связаны с этиологией сама болезнь и простота выявления и диагностики медицинскими профессионалы. Во-первых, длительный инкубационный период почти гарантирует, что некоторые из этих зараженные оспой будут перемещаться на большие расстояния от места заражения. воздействие до того, как болезнь будет распознана или введен карантин. 9 Вторая, две формы оспу — геморрагическую и злокачественную — очень трудно диагностировать. Первое почти всегда заканчивается смертельным исходом. 10 Третья, более легкая форма болезни, вызванной Variola minor инфекции или в результате остаточного иммунитета от предыдущей вакцинации, сделайте оспу сложнее диагностировать, поскольку основные симптомы, включая характерную сыпь, может отсутствовать. 11 В частности, наличие значительной части ранее вакцинированных лиц в Соединенные Штаты (родившиеся до 1972 г., когда были прекращены обязательные прививки) могут производить распознать приступ труднее. 12 Кроме того, многие американские врачи и медицинские профессионалы никогда не сталкивались с случаями оспы клинически или сталкивались с ними в далекое прошлое. Некоторые люди считают, что врачи могут быть недостаточно обучены диагностировать даже наиболее распространенные формы инфекции. Кроме того, идентификация осложняется тем, что болезнь может быть неочевидной или классической в предъявление до тех пор, пока пациент не станет заразным в течение трех-четырех дней, и возможно дольше. 13 Также, обычные лаборатории в настоящее время плохо оборудованы, чтобы помочь в быстром выявление инфекции.

Усилия по обучению врачей продвинулись вперед по двум направлениям фронты — специализированная подготовка и широкомасштабная осведомленность. В ноябре 2001 г. CDC приступили к обучению специализированных команд. 14 Команды, состоящие из врачей, эпидемиологов и лаборанты, были вакцинированы от оспы и прошли обучение выявлять и сдерживать вспышки. В рамках программы администрации Буша недавно объявленная политика, другие специалисты общественного здравоохранения будут вакцинированы с января 2003 г.Кроме того, в ряде ведущих клинических журналов есть опубликованные статьи, информирующие медицинских работников о клинических проявлениях оспы. аспекты, диагностика и лечение. Бесплатные курсы по подготовке к биотерроризму для врачи, особенно специалисты отделений неотложной помощи, были доступны на в Интернете с начала 2002 г. при поддержке ряда государственных и частных группы. 15, 16, 17 Несмотря на эти образовательные усилия, CDC, Американская медицинская ассоциация и несколько государственных медицинских обществ сообщили, что врачи остаются плохо информированными о диагностике оспы, побочных эффектах вакцины против оспы и план правительства по борьбе со вспышкой в ​​случае нападения. 18, 19

Насколько хорошо действуют противооспенные вакцины?

Для предотвращения заражения вакцинация считается высокоэффективной. В современная вакцина против осповакцины содержит живой вирус коровьей оспы, представитель натуральной оспы. семья, которая вызывает менее тяжелую инфекцию. Вакцина обычно вводится в верхней части руки и успешная иммунизация отмечается образованием характерный шрам. 20 В целом, Вакцинация против оспы не дает пожизненного иммунитета, а длится в среднем от пяти до семи лет.Однако иммунитет сильно различается у разных людей: от четырех месяцев до 10 лет. 21

Вакцинация также рекомендуется для предотвращения или облегчения болезни после заражение оспой. Вакцинация проводится в течение четырех-пяти дней после заражения. вероятно, предлагает значительную защиту от смерти, но не от инфекций и болезнь. 22 Успешно вакцинация вакциной происходит у впервые реципиентов более чем в 95 процентах случаев. прививок. Тем, кто не прошел первую вакцинацию, рекомендуется ревакцинация. рекомендуемые. 23

Неблагоприятные события

Основным мотивирующим фактором прекращения вакцинации в 1972 г. наличие нежелательных явлений, связанных с вакцинацией. Диапазон этих реакций от обычных и легких до редких и потенциально смертельных. Профиль побочных эффектов вакцина против оспы является более серьезной, чем любая другая широко используемая вакцина. вакцина. 24 Исторически сложилось так, что одна смерть приходилась на каждый миллион человек, получивших первичная вакцинация и примерно одна смерть на каждые четыре миллиона ревакцинированных.Опасные для жизни реакции возникали у 15 из миллиона человек. вакцинированы. 25 Риск нежелательных явлений и смерти у тех, кто был вакцинирован ранее, очень небольшой. Первичная вакцинация детей в возрасте до 10 лет является наиболее распространенной. рискованно согласно историческим данным.

Эти показатели могут недооценивать побочные эффекты сегодня, потому что США население включает больше людей, которые считаются подверженными высокому риску серьезных побочных эффектов эффекты. 26 Эти группы включают младенцев, пациентов с ослабленным иммунитетом, в том числе с ВИЧ / СПИД, беременная женщина и больные экземой. 27, 28, 29 Один аргумент в пользу предложение добровольных прививок позволяет провести тщательный скрининг и идентификация населения в целом для тех, кто может иметь высокий риск. 30

Недавно завершенное научное исследование выявило опасения, что представляет собой небольшой, но значительный риск того, что люди, получившие вакцинацию, могут распространять инфекцию среди непривитых людей. 31 В исследовании повторно проанализированы данные американцев, вакцинированных от впервые в 1963 и 1968 гг.На каждые 100 000 человек, вакцинированных от Впервые исследование показало, что осповакцина распространяется при близком контакте от двух до шести человек. другие, не вакцинированные ранее. Большинство невакцинированных людей, заразившихся вирусом развились «случайные инфекции», состоящие из язв, которые зажили сами по себе и, скорее всего, действовали как вторичные прививки, которые давали им иммунитет. Однако один или два человека, инфицированные вторично, стали очень болен заболеванием, называемым вакцинальной экземой, которое может вызвать жар и тяжелые обширная сыпь, рубцы и, в редких случаях, смерть.Из тех, кто заражен с другой стороны, подавляющее большинство случаев произошло у детей младше 5 лет, которые заразились инфекция от члена семьи. Другие отмечают, что в 1968 году из 14 168 000 прививок было зарегистрировано 114 случайных прививок другие и одна смерть у маленького ребенка. В 1963 году не было связанных смертей. при случайных прививках. 32

Доступность лечения нежелательных явлений

Лица, у которых возникли серьезные осложнения от вакцины, являются дали иммуноглобулин коровьей оспы (VIG).Поставки VIG ограничены. 33 Если бы один миллион человек был пройти вакцинацию, до 250 человек испытают побочные реакции требующие администрирования VIG. 34 Сколько ВИГ потребуется для вакцинации населения программа неопределенная. По состоянию на январь 2003 г. в CDC было около 5000 доз VIG. в руке. 35 В августе 2002 г. CDC заключила контракт с канадской компанией Cangene на производство 100 000 дополнительных Дозы VIG, поставка которых запланирована на середину 2003 года. 36

Доступность вакцины

После терактов 11 сентября была проведена одна из первых федеральных акций по подготовке для потенциальной биотеррористической атаки была подробная оценка CDC адекватность поставок вакцин и терапевтических средств, размещенных в Национальном фармацевтическом Запасы (NPS). По состоянию на ноябрь 2001 г. было введено 15 миллионов доз вакцины Dry-vax. доступный. 37 Национальный Институты здравоохранения провели исследования, которые предполагают, что можно разбавить Вакцина Dry-vax в соотношении 1:10, что позволит произвести 150 миллионов доз за короткое время. срок. 38 Этого недостаточно вакцинировать все население в случае чрезвычайной ситуации или провести немедленная вакцинация населения. 39

Авентис Пастер объявил в начале апреля 2002 г., что планирует сделать пожертвование правительство 85 миллионов дополнительных доз вакцины, подобной Dry-vax, которая хранились в морозильных камерах 40 лет. 40 Эксперименты в пробирках были недавно завершены и предполагают что вакцина примерно такая же мощная, как Dry-vax. Эффективность разбавления Авентиса вакцина также проходит испытания в настоящее время.

В ноябре 2001 года правительство США разместило срочный заказ на Британо-американская компания Acambis за 155 миллионов доз новой противооспенной вакцины, в дополнение к 54 миллионам доз, заказанных в 2000 году. Соединенные Штаты заплатили 428 долларов миллиона, или 2,76 доллара за дозу. Клинические испытания вакцины начались в марте 2002 г. и первый заказ был доставлен в конце 2002 года. 41 В чрезвычайной ситуации правительство США в настоящее время имеется достаточно вакцины Dry-vax (если она разбавлена) и вакцины Acambis для вакцинации население. 42 Старшее Вакцина Dry-vax — это вакцина, которую в настоящее время вводят военным. персонал, медицинские работники и службы быстрого реагирования. Это новейшая вакцина Акамбис. которую администрация Буша планирует распространять среди населения на добровольных началах прививки.

В долгосрочной перспективе учитывается частота осложнений после вакцинации. достаточно хорошо, чтобы рекомендовать разработку эффективной вакцины, связанной с меньше побочных эффектов. 43 Исследователи финансируется Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID). разработка новой вакцины (модифицированная вакцина против оспы Анкара или MVA), в настоящее время клинические испытания.Планируется произвести, лицензировать и получить около 250 миллионов доз. доставлен в федеральное правительство к 2005 году. NIAID надеется продемонстрировать, что MVA будет безопасным для использования в группах высокого риска. 44 Альтернативная вакцина (японская LC16m8) может содержать меньше побочные эффекты, чем вакцина NIAID, и быть более безопасным продуктом для использования в целом популяция, но, вероятно, не будет использоваться для иммунодефицитных частные лица. 45 FDA лицензирование этой вакцины до 2005 г. маловероятно. 46

Ответственность за вакцину

Федеральное правительство владеет всеми американскими запасами вакцины Dry-vax. В вакцина полной силы и ее разбавленные версии были лицензированы для использования в общественности Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в конце 2002 года. 47 Клинические испытания для установления безопасности и эффективность вакцины Авентис Пастер продолжается, при этом CDC оценивает завершение в начале 2003 г. Вакцина Акамбис в настоящее время также проходит клинические испытания. тестирование и находится в ускоренном порядке для утверждения лицензии FDA. 48

Использование существующих и новых противооспенных вакцин порождает две проблемы с ответственностью. Во-первых, предложение вакцины населению до нападения вызывает опасения. об ответственности за неблагоприятные события для компаний-производителей, здоровья учреждения, и медицинский персонал, который делает вакцины.

Во-вторых, в случае нападения, преимущества и риски вакцинации необходимо будет взвесить для людей с повышенным риском возникновения серьезных осложнения, связанные с вакцинацией.В настоящее время нет абсолютных противопоказания к вакцинации человека с высоким риском воздействия оспа. 49 Однако, люди с наибольшим риском серьезных осложнений вакцинации часто тем, кто подвергается наибольшему риску смерти от оспы. Помимо иммунодефицитных и другие, упомянутые выше, дети в возрасте до 18 лет считаются находящимися в повышенный риск. Хотя раньше детям делали плановую иммунизацию при заражении оспой. естественным заболеванием, Консультативный комитет по практике иммунизации (ACIP) в настоящее время не рекомендует использовать вакцину против оспы у детей младше 18 лет, за исключением экстренных случаев. 50 В случае нападения риски дети и другие лица из группы высокого риска, испытывающие серьезные осложнения после вакцинации необходимо взвесить с учетом повышенного риска заражения оспой со смертельным исходом инфекционное заболевание. Использование противооспенных вакцин среди населения и потенциально в эти группы высокого риска после нападения вызывают опасения по поводу ответственности за нежелательные явления для производственных компаний, медицинских учреждений и медицинских персонал, который делает вакцины. Некоторые политики предполагают, что компенсационный фонд должны быть созданы для выплаты вознаграждения жертвам значительных неблагоприятных событий, связанных с с введением вакцины взрослым и детям в экстренных случаях обстоятельства.

Затраты на государственные добровольные прививки от оспы

В рамках новой программы добровольной вакцинации администрация Буша объявили, что добровольные прививки от оспы будут доступны бесплатно для лица, желающие пройти вакцинацию. 51 По оценке CDC, усилия по скринингу и вакцинации против оспы будет стоить от 5 до 10 долларов на пациента, что составит 132 миллиона долларов на одного пациента. 265 миллионов долларов. Прочие расходы на обучение медицинского персонала, снабжение хранение, распространение и транспортировка потребуют дополнительных финансовых средств. 52 Некоторые считают, что экстренная мобилизация для вакцинация населения в случае чрезвычайной ситуации в области общественного здравоохранения может стоить даже более. 53

Сдерживание

Сторонники добровольной вакцинации против оспы для населения США считают широко распространенная добровольная вакцинация резко снизит ценность оспы как оружие. 54 В случае атаки, количество неиммунизированных значительно сократится, а вспышка будет намного легче управлять, подавит общественную панику и снизит нагрузку на общественность. ресурсы здравоохранения.

Государственное образование

Согласно последним опросам общественного мнения, американцы обеспокоены об угрозе оспы. Однако в целом публика остается относительно не осведомлены о симптомах болезни, легкости передачи и риски вакцины. 55 Сторонники программы добровольной вакцинации предполагают, что политика также требует сопутствующая образовательная кампания по информированию людей о рисках заболевания вакцинация, возможные побочные эффекты, соответствующие медицинские работники проконсультируйтесь и по другим важным вопросам.Кроме того, необходимо приложить дополнительные усилия, чтобы обучать врачей относительно введения вакцины, идентификации стороны вакцины эффекты и консультирование пациентов относительно рисков и преимущества.

Планы реализации

С недавно опубликованной политики по вакцинации населения начинается в 2004 г. CDC — агентство при Министерстве здравоохранения и Службы (DHHS), которые в первую очередь отвечают за обнаружение и отслеживание инфекционных заболеваний. болезни — и другие федеральные агентства и агентства штата должны будут подготовить планы для отправка Национального фармацевтического запаса, связь с государством и местные органы общественного здравоохранения, а также другие приготовления к добровольному общественному вакцинация должна начаться в 2004 году.В частности, инфраструктура общественного здравоохранения государственным и местным отделам здравоохранения потребуются ресурсы и планы готовности к проводить широкомасштабные вакцинации. 56 Многие государственные и местные чиновники здравоохранения утверждают, что они нужно больше времени для обучения медицинского персонала и общественности, снизить риск осложнений от вакцины, убедитесь, что лечение в больнице не пострадает, если привитые работники плохо себя чувствуют, обеспечьте доступность и оплату медицинских и персонал общественного здравоохранения, и определить, кто будет нести ответственность претензии, потерянная работа и сопутствующие медицинские принадлежности. 57 Федеральные чиновники заявили, что усилия были предприняты в прошлом несколько месяцев на подготовку государственных и местных медицинских учреждений к добровольному иммунизация и экстренная вакцинация в случае приступа оспы должны прошло хорошо. 58

Подготовка к атаке оспы

С 11 сентября эксперты со всех сторон обсуждают добровольную вакцинацию указали на неадекватность общественного здравоохранения на федеральном уровне, уровне штата и на местном уровне. инфраструктура для выявления вспышки, координации распределения вакцин и эффективно сдерживать инфекцию в случае биотеррористической атаки, отсутствующей или предшествующей к массовому общественному иммунитету .59, 60, 61 В частности, федеральные усилия по обеспечению готовности носят фрагментарный характер. через многие агентства с ограниченными обязанностями. Главное бухгалтерское управление исследования усилий по обеспечению готовности к биотерроризму показывают, что более 20 федеральных департаменты и агентства участвуют в подготовке или реагировании на связанные со здоровьем аспекты биотеррористической атаки, и более 40 агентств несут ответственность за ответ на терроризм в более широком смысле. 62 Кроме того, государственные и местные органы здравоохранения относительно неподготовлен.Большинство из них требует большей способности для быстрой связи с больницы и другие учреждения здравоохранения. 63 Не все агентства имеют доступ к электронной почте, а у тех, которые есть, часто есть не имеют возможности отправлять конфиденциальную информацию. Персонал обычно не Включите дежурного 24 часа в сутки для экстренных случаев. 64 CDC разработала две коммуникации системы, как на ранних стадиях разработки, так и для устранения недостатков в информации обмен. Способность городских и окружных больниц справиться с быстрым наплывом пациентов на вакцинация, лечение инфекций, выявление и контроль нежелательных явлений также был источником беспокойства. 65

Многочисленные усилия были предприняты на федеральном уровне, уровне штата и на местном уровне. уровни для решения этих проблем. В ноябре 2001 г. администрация Буша создала Управление готовности общественного здравоохранения при DHHS. Назначение этого офиса заключается в координации реакции федеральных агентств на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, включая обслуживание Столичной системы медицинского реагирования, Национальной Медицинская система при бедствиях, национальный фармацевтический запас, поддержка CDC для местных Системы реагирования и исследования и разработки вакцин и лекарств.Департамент Национальная безопасность была создана в ноябре 2002 года Законом о внутренней безопасности (P.L. 107-296). Его основная цель — контролировать координацию антитеррористических мероприятия на федеральном, государственном и местном уровнях, включая подготовку к общественному добровольные прививки и биотеррористическая атака. Закон установил министр внутренней безопасности на уровне кабинета министров. DHHS поддерживает первичный власть над исследованиями и разработками в области биозащиты, уступая при этом контроль над некоторыми национальные системы реагирования на чрезвычайные ситуации, включая управление АПЛ.Офис готовности общественного здравоохранения также переданы в ведение Департамента национальной безопасности. Закон также обеспечивает защиту ответственности врачей и другие медицинские работники, которые вводят вакцины против оспы в случае приступа или через скоординированные усилия по добровольной вакцинации.

Текущая готовность

В случае нападения до вакцинации населения, CDC директор заявил, что участки НПВ, где в настоящее время доступны вакцины против оспы, находятся хранятся, готовы, и есть планы по быстрой доставке конечного продукта на все города с населением более 10 000 человек. 66 Остаются опасения по поводу небольших городов и округов. Некоторые государственные и местные чиновники здравоохранения жаловались, что они получили мало указаний о том, сколько вакцины будет доступно и какие планы будут сопровождают распространение этих материалов. 67

В сентябре 2002 года CDC выпустил обновленные инструкции для штатов. для вакцинации каждого американца в случае подтвержденного вспышка. 68 Центр контроля заболеваний политика гласит, что в случае нападения вакцинация будет добровольной, но любой, кто подвергся заражению и отказывается от вакцинации, может быть недобровольно на карантине до 18 дней.Последнее правило является частью «кольца вакцинация », с помощью которого пациенты с подозреваемым или подтвержденным оспа изолирована, контакты пациентов отслеживаются, вакцинируются, и находился под пристальным наблюдением. 69 Недавно обновленная политика CDC по оспе также предусматривает: специальные инструкции по логистике для штатов в отношении распределения вакцин и обработка нежелательных явлений для крупномасштабных посттактических атак прививки. 70 Сторонники предполагают, что текущая политика CDC снижает нагрузку на персонал. требований и инфраструктуры и может подавить общественную панику в случае атака.Некоторые критиковали адекватность метода кольцевой вакцинации сдерживать вспышку в случае нападения. 71 Другие отмечают, что даже с большими деньгами может не хватить обученных эпидемиологов, лаборантов, врачей, и других экспертов в области общественного здравоохранения для реализации текущего плана CDC эффективно. 72

Гражданские свободы

Для сдерживания заражения оспой после крупномасштабной атаки, федеральные, государственные и местные органы власти, особенно органы здравоохранения, могут нуждаться в предпринимать действия, ограничивающие гражданские свободы в рамках действующего кольца политика вакцинации.

В 2001 году CDC выпустил Типовой закон штата о чрезвычайных медицинских полномочиях, разработан Центром права и общественного здравоохранения Джорджтаунского университета и Университет Джона Хопкинса. 73 Типовой закон призван служить потенциальной основой для государств. использовать при обновлении устава. Существующие государственные законы, многие из которых были написаны до 1930-х годов, обычно содержат мало подробностей о сфере полномочий департамента здравоохранения в аварийные ситуации. 74 В Типовое законодательство предоставляет широкие полномочия должностным лицам здравоохранения в том случае, если губернатор объявляет чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения.В частности, положения разрешить органам общественного здравоохранения проводить обязательные медицинские осмотры, изолировать инфицированных людей и изолировать контактировавших с ними людей «в отношении личные свободы в соответствии с надлежащей правовой процедурой «. Обязательный вакцинация, сбор лабораторных анализов и ограниченное раскрытие информации о пациенте записи также разрешены. 75 Такие положения вызвали дебаты относительно надлежащего уровня полномочий для предоставить правоохранительным органам в экстренных случаях. Ожидается, что государства рассмотрят законодательство о государственной власти в чрезвычайных медицинских ситуациях в ближайшем будущем. законодательные сессии.

Последние законодательные акты

Законодательство, принятое в 2001 и 2002 годах, устраняет опасения относительно создание запасов вакцин, разработка новых вакцин и других терапевтических средств, а также дальнейшая подготовка инфраструктуры общественного здравоохранения.

  • Закон 2001 г. о дополнительных чрезвычайных ассигнованиях на возмещение и ответ на террористические атаки на Соединенные Штаты (P.L. 107-38) чрезвычайные дополнительные ассигнования на антитеррористические инициативы и помощь в восстановлении после терактов 11 сентября.Ассигнования включены 865 миллионов долларов на гранты CDC на улучшение штата и местных потенциал готовности к биотерроризму и реагирования на него, включая использование оружия против оспы. DHHS направил 20 процентов этих средств на штатов и населенных пунктов в феврале 2002 года. Остальные планируется выпускается после получения DHHS планов по обеспечению биологической готовности штата и местных органов власти. По состоянию на декабрь 2002 года DHHS распределил 747 долларов. миллион. 76 дюйм Кроме того, было выделено 512 миллионов долларов на закупку противооспенных вакцин. ассигнованы и выплачены.Конгресс также выделил 32 миллиона долларов. для NIH-NIAID для увеличения запасов противооспенной вакцины и исследований, а также разработка.

  • Безопасность общественного здравоохранения и готовность к биотерроризму и Закон о реагировании 2002 г. (P.L. 107-188) требует предоставления эффективных помощь штатам и местным органам власти, чтобы гарантировать, что у них есть способность обнаруживать биотеррористические атаки и эффективно реагировать на них. Это назначил в DHHS помощника секретаря по чрезвычайным ситуациям в области общественного здравоохранения готовность координировать такие усилия.Закон направляет секретаря здравоохранения и социальных служб, чтобы гарантировать, что достаточное количество оспы вакцина доступна. Ассигнования на достижение этих целей были выделены Конгресс, в том числе 1,5 миллиарда долларов для штатов на улучшение обороны против биологических атак, увеличить государственные запасы вакцин и другие медицинские принадлежности, расширение и обслуживание больничного оборудования, а также обучение медицинские работники.

Выводы

Использование оспы как оружия против U.S. население вызывает беспокойство угроза с национальными и потенциально международными последствиями. Предлагая добровольные вакцинация против оспы для населения представляет преимущества, которые необходимо сопоставить сопутствующие медицинские, логистические и экономические риски. Директивным органам необходимо ориентироваться в сложных напряженность между научной и политической неопределенностью, а также между роль правительства в защите своих граждан, гарантируя право личности на самоопределение.

Программа добровольной вакцинации поднимает ряд сложных вопросов, включая размер уязвимого населения, использование передачи вируса среди затронутые люди, простота диагностики, доступность и связанные с ними побочные эффекты вакцинами и адекватностью инфраструктуры общественного здравоохранения для выполнения добровольные вакцинации населения при подготовке к выявлению и сдерживанию нападения.

Сноски

Фонд Содружества — частный фонд, поддерживающий независимые исследования здоровье и социальные проблемы. Представленные здесь точки зрения принадлежат автору и не должны относиться к Фонду Содружества или его директорам, должностным лицам или сотрудники.

Список литературы

2. Алибек К. Биологическая опасность: пугающая правдивая история о крупнейшем тайном биологическом Программа оружия в мире, рассказанная изнутри сбежавшим Это. Нью-Йорк: Рэндом Хаус; 1999 г.[Google Scholar]

3. Там же.

6. Blendon RJ, et al. Общественность и угроза оспы. Медицинский журнал Новой Англии. 2002 Dec 19; Онлайн. [Google Scholar]

7. Variola minor иногда называют аластримом.

9. Drazen JM. Оспа и биотерроризм. Медицинский журнал Новой Англии. 2002 25 апреля; 346: 1262–63. [PubMed] [Google Scholar] 10. Хендерсон Д.А., Инглсби Т.В., Бартлетт Дж. Г. и др. Оспа как биологическое оружие: медицина и общественное здравоохранение Управление. Журнал Американской медицинской ассоциации.1999; 281: 2127–37. [PubMed] [Google Scholar]

12. Там же.

13. Бикнелл WJ. личное общение. 27 января 2003 г.

20. Хендерсон, Моховая оспа и оспа. 2002

21. Там же.

22. Бикнелл WJ. личное общение. 27 января 2003 г. Оспа Хендерсона как биологическое оружие. 1999 [Google Scholar]

23. Там же.

25. Бреман Дж. Г., Хендерсон Д. А.. Диагностика и лечение оспы. Медицинский журнал Новой Англии. 2002 25 апреля; 346: 1300–08. [PubMed] [Google Scholar] 26.Бикнелл WJ. Случай добровольной вакцинации против оспы. Медицинский журнал Новой Англии. 2002 25 апреля; 346: 1323–25. [PubMed] [Google Scholar]

27. Определяются как люди с ВИЧ-инфекцией, принимающие лекарства для подавления отказ от трансплантации органов, лица с наследственным иммунодефицитом расстройства и те, кто лечится от рака.

29. Там же

31. Нефф Дж. М., Лейн Дж. М., Фульгинити В. А., Хендерсон Д. А.. Контактная оспа: передача оспы Вакцинация. Журнал Американской медицинской ассоциации.2002 16 октября; 288: 1901–05. [PubMed] [Google Scholar]

32. Бикнелл В.Дж. личное общение. 27 января 2003 г.

33. Берман-диагностика и лечение оспы. 2002 [Google Scholar]

36. Там же

37. Кимонс М. США разбавляет поставки вакцины против оспы. Природная медицина. 2001 Декабрь; 7: 1265. [PubMed] [Google Scholar] 39. Fauci AS. Политика вакцинации против оспы: необходимость Диалог. Медицинский журнал Новой Англии. 2002 25 апреля; 346: 1319–20. [PubMed] [Google Scholar] 40. Lane JM. Оспа и вакцинация против оспы.Медицинский журнал Новой Англии. 2002 29 августа; 347: 691–92. [PubMed] [Google Scholar] 41. [доступ 28 ноября 2001 г.]; HHS присуждает контракт на производство оспы на сумму 428 миллионов долларов. Вакцина. Пресс-релиз. доступно на http://www.dhhs.gov/

43. Там же.

45. Бикнелл В., Джеймс К. Новая культура клеток: вакцина против оспы должна быть предложена Основное население. Обзоры в медицинской вирусологии. 2003; 13: 5–15. [PubMed] [Google Scholar]

46. Там же.

48. Там же.

49. Там же.

51.Альтман Л.К., Грэди Д. Прививка от оспы будет бесплатной для тех, кто ее хочет. Нью-Йорк Таймс. 2002 Dec 15; Онлайн. [Google Scholar]

54. Там же

56. Биотерроризм: федеральные исследования и меры по обеспечению готовности. 2001 Sep; ГАО-01-915. доступен по адресу http: //www.gao.gov. Третий годовой отчет Президенту и Консультативному Конгрессу. Группа по оценке внутренних возможностей реагирования на террористические акты Оружие массового поражения. III. Для Рэя Дауни; 15 декабря 2001 г. [Google Scholar] Стерн Дж.Абсолютные террористы. Кембридж: издательство Гарвардского университета; 1999. [Google Scholar] 57. Альтман LK, Broad WJ. График опроса государственных служащих по оспе Вакцина. Нью-Йорк Таймс. 2002 Dec 13; Онлайн. [Google Scholar]

58. Там же

60. Главное бухгалтерское управление. [доступ 26 ноября 2002 г.]; Борьба с терроризмом: ответственность за потребности в медицинских материалах. Улучшение. ГАО-01-666Т. Доступно по адресу http: //www.gao.gov.62. Биотерроризм: обзор готовности общественного здравоохранения Программ.Заявление Джанет Генрих; Свидетельские показания в Подкомитете по надзору и расследованиям, Комитет по энергетике и торговле, Палата представителей, ГАО-02-149Т; [просмотрено 11 декабря 2002 г.]. Доступно на http://www.gao.gov/ [Google Scholar] 63. Американская ассоциация общественного здравоохранения. Свидетельские показания Мохаммада Н., Ахтера, доктора медицины, магистра здравоохранения. Представлено Подкомитету по национальной безопасности, делам ветеранов, и по международным отношениям Комитета при Правительстве Палаты представителей Реформа; 29 ноября 2001 г .; [просмотрено 11 декабря 2002 г.].Доступно на http://www.gao.gov/ [Google Scholar] 64. Департамент здравоохранения штата Айова. [просмотрено 12 декабря 2002 г.]; Заявление Патрисии Куинлиск, подкомитету Сената по труду и здоровью, и ассигнования на социальные нужды и образование, слушания Биотерроризм. 2001 Oct 3; Доступно на http://www.gao.gov/

65. Там же

68. Там же.

69. Консультативный комитет по практике иммунизации (ACIP) [по состоянию на 13 августа 2002 г.]; Проект дополнительной рекомендации ACIP: Использование натуральной оспы. (Vaccinia) Вакцина.2002 июн; Доступно по адресу http://www.cdc.gov/nip/smallpox/supp_recs/72. Каплан EH, Craft DL, Wein LM. Экстренное реагирование на оспу: аргументы в пользу массовости Вакцинация. Труды Академии наук Соединенных Штатов Америки Америка. 2002 6 августа; 99: 10935–40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Департамент здравоохранения и социальных служб. [доступ 26 ноября 2002 г.]; Заявление секретаря Томми Г. Томпсона относительно типовой чрезвычайной ситуации. Закон о полномочиях в области здравоохранения. 2001 Oct 30; Доступно по адресу http: // www.gao.gov/74. Хендерсон Д.А. [доступ 12 ноября 2002 г.]; Свидетельство в Сенате США, Комитет по международным отношениям, Слушание Угроза биотерроризма и распространения инфекционных заболеваний. 2001 Sep 5; Доступно на http://www.gao.gov/75. Центр права и общественного здоровья. ПРОЕКТ законодательных требований. Типовой закон штата о чрезвычайных медицинских услугах от 23 октября 2010 г. 2001. [Google Scholar]

Сублимированная живая аттенуированная противооспенная вакцина, приготовленная на культуре клеток «LC16-KAKETSUKEN»: постмаркетинговое надзорное исследование безопасности и эффективности в соответствии с Надлежащей клинической практикой

https: // doi.org / 10.1016 / j.vaccine.2015.09.067Получить права и контент

Реферат

Предыстория

В Японии производство противооспенной вакцины LC16m8 (названной LC16-KAKETSUKEN) было возобновлено, и в марте 2002 г. было решено сохранить ее в качестве национального запаса.

Цель

Провести постмаркетинговое эпиднадзорное исследование вакцинации лиофилизированной живой аттенуированной противооспенной вакциной, приготовленной в культуре клеток LC16-KAKETSUKEN с использованием аттенуированного штамма осповакцины LC16m8.Исследование соответствовало Надлежащей клинической практике, с упором на сравнение между вакцинированными первично и повторно вакцинированными.

Метод

268 сотрудников (261 мужчина и 7 женщин) Сухопутных сил самообороны Японии были вакцинированы LC16-KAKETSUKEN, после чего были оценены побочные эффекты и эффективность.

Результаты

Среди 268 вакцинированных участников следующие вакцинированные показали побочные эффекты, не являющиеся серьезными: 53 из 196 первичных вакцинированных (без предыдущей вакцинации против оспы), 4 из 71 повторно вакцинированных (с предыдущей вакцинацией против оспы) и 1 вакцинированный с неизвестной предыдущей вакцинацией. история вакцинации.Разбивка нежелательных явлений, наблюдаемых в этом исследовании (всего 268 вакцинированных), показала следующие незначительные или легкие нежелательные явления: 52 (19,4%) отек подмышечных лимфатических узлов, 4 (1,5%) лихорадка, 2 (0,7%) усталость, 1 ( 0,4%) сыпи, 14 (5,2%) покраснений на месте прививки, 1 (0,4%) опухоль на месте прививки и 1 (0,4%) автоинокуляция. Частота нежелательных явлений у первичных вакцинированных (53/196; 27,0%) была значительно выше, чем у повторно вакцинированных (4/71; 5,6%). Однако доля вакцинированных среди первичных вакцинированных была значительно выше (185/196; 94.4%), чем у повторно вакцинированных (58/71; 81,7%). Хотя доля вакцинированных повторно вакцинированных была значительно ниже, чем у первичных вакцинированных, из-за иммунитета, имевшего место в результате предыдущей вакцинации, не было обнаружено существенной разницы в титрах нейтрализующих антител между первичными вакцинированными и повторно вакцинированными через 1, 4 и 7 месяцев после LC16. -KAKETSUKEN вакцинация.

Заключение

Настоящее постмаркетинговое надзорное исследование, соответствующее Надлежащей клинической практике, продемонстрировало эффективность и безопасность противооспенной вакцины LC16-KAKETSUKEN для взрослого населения.LC16-KAKETSUKEN — единственная имеющаяся в настоящее время лицензированная вакцина против оспы как для взрослого, так и для педиатрического населения.

Ключевые слова

Аттенуированная противооспенная вакцина

LC16m8

LC16-KAKETSUKEN

Постмаркетинговое исследование

Безопасность

Эффективность

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Авторы

Авторские права © 2015 Авторские права © Авторские права Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Агонисты TLR3 и TLR9 повышают эффективность вакцинации живыми противооспенными вакцинами после контакта

Abstract

Ликвидация оспы и прекращение кампании вакцинации привело к увеличению процента невакцинированных лиц, что подчеркивает необходимость принятия эффективных контрмер после контакта в случае случайного или преднамеренного выброса вируса.Интраназальная инфекция мышей вирусом эктромелии (ECTV), моделью оспы человека, излечима путем вакцинации высокой дозой вакцины, вводимой в течение 3 дней после контакта. Для дальнейшего расширения этого защитного окна и снижения заболеваемости мышей после контакта вакцинировали вакциной Vaccinia-Lister, обычной противооспенной вакциной, или модифицированной вакциной против оспы Ankara, сильно аттенуированной вакциной в сочетании с агонистами TLR3 или TLR9. Мы показываем, что совместное введение агониста TLR3 поли (I: C) даже через 5 дней после контакта обеспечивает защиту, избегая необходимости увеличивать дозу вакцинации.Эффективные методы лечения предотвращали смерть, улучшали симптомы заболевания, снижали вирусную нагрузку и поддерживали целостность тканей органов-мишеней. Защита была связана со значительным повышением уровня сывороточного IFNα и антител против вакцины IgM, модуляцией ответа IFNγ и сбалансированной активацией NK- и T-клеток. Агонисты TLR9 (CpG ODN) обладали меньшей защитой, чем агонист TLR3 поли (I: C). Мы показываем, что активация IFN типа 1 с помощью поли (I: C) и защита достижимы даже без совместной вакцинации, требующей достаточного количества вирусных антигенов инфекционного агента или вакцины.Это исследование продемонстрировало терапевтический потенциал постконтактной иммунной модуляции за счет активации TLR, что позволяет облегчить симптомы заболевания и еще больше расширить защитное окно постконтактной вакцинации.

Образец цитирования: Israely T, Melamed S, Achdout H, Erez N, Politi B, Waner T, et al. (2014) Агонисты TLR3 и TLR9 повышают эффективность вакцинации живыми противооспенными вакцинами после контакта. PLoS ONE 9 (10): e110545. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545

Редактор: Джозеф Дж. Маттапаллил, Университет силовых структур, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 8 июня 2014 г .; Одобрена: 14 сентября 2014 г .; Опубликовано: 28 октября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Israely et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе результатов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась внутренним институтом (Израильский институт биологических исследований). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Вирус натуральной оспы (VARV), возбудитель оспы, унес жизни сотен миллионов людей на протяжении всей истории до объявления Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) около трех десятилетий назад о том, что оспа искоренена. Это было достигнуто посредством всемирной кампании вакцинации с использованием вакцинных штаммов вируса осповакцины (VACV) и других близкородственных членов семьи [1]. Ликвидация болезни позволила постепенно прекратить кампанию вакцинации, что привело к увеличению доли неиммунизированных лиц во всем мире.Растущее беспокойство по поводу того, что оспа может возникнуть в результате случайного или преднамеренного высвобождения VARV, подчеркивает необходимость принятия эффективных контрмер после контакта (ч.э.), которые могут быть легко и быстро применены для массовой вакцинации [2].

Относительно длительный инкубационный период оспы человека, составляющий около 7–14 дней, открывает окно в несколько дней для необязательных р.э. вмешательство [3]. Анекдотические сообщения о защите p.e. вакцинация указывает на потенциальную пользу этого лечения [4].Используя вирус эктромелии (ECTV), возбудителя оспы мышей, мы вместе с другими продемонстрировали сходство различных аспектов заболевания между оспой мышей и оспой человека, обосновывая актуальность этой модели на животных для моделирования различных аспектов болезни человека и измерения показателей заболеваемости. защита [5] — [9]. В этой животной модели p.e. методы лечения были исследованы с использованием различных вакцинных штаммов [8], противовирусных препаратов [7], [10], [11] и антител [12]. В соответствии с историческими исследованиями на людях вакцинация мышей VACV давала твердый p.е. защита при предоставлении до 3 дней p.e. при высокой дозе вакцинации [8]. Сравнимые результаты были получены с вакциной MVA, сильно аттенуированной. Оба придают п.э. Однако вакцинация — единственный метод с одобренной эффективностью в борьбе с оспой, обеспечивающий как краткосрочный, так и долгосрочный иммунитет.

Защита по п.э. Активная вакцинация требует индукции быстрого и мощного, но стойкого иммунного ответа. Несмотря на довольно длительный инкубационный период, уклонение от иммунитета хозяина этими вирулентными вирусами и скорость развития иммунитета (врожденного и адаптивного) снижает эффективность p.е. вакцинацию и ограничьте окно защиты первыми 3–4 днями р.э. Ранее мы показали, что, по крайней мере, на модели животных ECTV на мышах, эффективность p.e. на защиту с помощью активной вакцинации сильно влияет доза вакцины (предпочтительно 1 × 10 8 БОЕ либо VACV-Lister, либо MVA) [8]. Неизвестно, актуально ли это и для людей, однако материально-технические последствия увеличения дозы вакцинации (для VACV) требуют альтернативного механизма быстрого индуцирования сильного иммунитета.Одним из возможных способов повышения эффективности иммунного ответа является совместное введение адъювантов с вакциной. Совместное введение адъювантов и вакцин перед воздействием широко используется в качестве одобренного протокола для усиления иммунного ответа на нерепликативные антигены: очищенные белки, ДНК или целые инактивированные вирусы или бактерии [13].

Семейство TLR, также известное как рецепторы распознавания образов (PRR), включает у людей 10 членов (TLR1-10) трансмембранных рецепторов, которые распознают молекулы общих консервативных паттернов (например,грамм. чужеродная ДНК, РНК, липосахариды и липопротеины) [14], [15]. Передача сигнала после активации рецептора опосредуется адапторными молекулами, такими как MyD88, TRIF, IRF3, IRF7 и IKK, которые запускают внутриклеточный каскад, приводящий к активации IFN-ответа I типа и / или секреции воспалительных цитокинов и усилению врожденного иммунитета против инвазивного возбудитель [16]. Эти рецепторы и их адаптеры играют важную роль в активации врожденного, а затем и адаптивного иммунитета.Специфичность TLR 3, 7, 8 и 9 к нуклеиновым кислотам (ДНК и РНК) и их эндосомная локализация позволяют обнаруживать вторгающиеся патогены и развивать иммунитет к вирусным инфекциям [17]. TLR9 обнаруживает неметилированные мотивы CpG, присутствующие с высокой частотой в ДНК микробов, а не млекопитающих [18], [19], и экспрессируется в основном плазмацитоидными DC (pDC), B-клетками, моноцитами и зрелыми макрофагами, в то время как TLR3 (экспрессируется DC, B-клетками). , эпителиальные и эндотелиальные клетки) запускается двухцепочечной РНК (дцРНК), продуцируемой во время репликации, главным образом, РНК вирусов [20] — [22].Иммуностимулирующий эффект TLR3 и TLR9 может имитироваться синтетическими аналогами дцРНК (т.е. поли (I: C)) и олигонуклеотидами (т.е. ODN, содержащими мотивы CpG), соответственно. Были описаны три основных класса CpG ODN [16], [23] из которых мы исследовали в этом исследовании ODN типа «A», которые запускают pDC для производства IFN и тем самым активируют ответ T- и NK-клеток и «B». ODN типа, известный как сильный модулятор активации B-клеток.

Роль TLR в обнаружении бактериальных и вирусных компонентов и индукции иммунитета заложила основу для разработки и использования агонистов TLR в качестве молекулярных адъювантов для улучшения иммунного ответа вакцин [23].Примеры включают оценку лиганда TLR3 при гриппе [24]; и вакцины против вируса папилломы человека (HPV, [25]), лиганд TLR5 в вакцине против гриппа [26], [27], лиганд TLR9 в вакцине против малярии [28], [29] и лиганд TLR4 в вакцине против вируса гепатита B [30] ]. Некоторые из этих лигандов TLR находятся на стадии доклинических и клинических испытаний, в то время как AS04 (MPLA, агонист TLR4, содержащий квасцы) одобрен для клинического использования в качестве адъюванта вакцины против ВПЧ в Европе [31].

Геном поксвирусов представляет собой большую дцДНК (примерно 180–200 кбит / с), кодирующую около 200 ORF.Предварительная обработка противооспенной вакциной на основе белка, содержащей CpG-ODN и адъюванты квасцов [32] или QS-21 [33], улучшала иммуногенность и защиту, обеспечиваемые рекомбинантными белками без адъювантов. GM-CSF или E. coli термолабильный энтеротоксин (LT) усиливали защитные реакции антител на вакцину на основе гена 4pox у мышей [34]. Интересно, что также интраназальная вакцинация инактивированным вирусом осповакцины, приготовленным с поли (I: C), давала более высокий титр антител, чем вакцина без адъюванта, что позволяет предположить, что обнаружение чужеродных нуклеиновых кислот вызывает противовирусные иммунные ответы, независимо от точного состава их генетического материал [35].

Повышенная заболеваемость у инфицированных поксвирусом мышей с дефицитом TLR9 подчеркнула важность TLR9 для защиты от поксвирусных инфекций и развития специфического иммунитета к поксвирусу [36]. Кроме того, в рамках своей стратегии уклонения от иммунитета поксвирусы кодируют несколько белков вирулентности (N1, A52, A46), которые, как известно, ингибируют внутриклеточную передачу сигналов с помощью ряда TLR [37]. Важная роль TLR в приобретении быстрого иммунного ответа подчеркивает потенциальную пользу p.e. Активация TLR.

Независимо от специфичности лиганда TLR до сих пор эти лиганды были приготовлены с белками или инактивированными вирусами и использовались в качестве адъювантов в вакцинах, вводимых в сценарии до контакта. В настоящем исследовании мы оценили вклад совместно вводимых агонистов TLR в защитный иммунный ответ, вызываемый живыми вакцинами (VACV-Lister или MVA) в п.в. сценарий. Мы также показываем, что агонист TLR3 обеспечивает защиту даже без вакцин, но для этого требуется достаточное количество вирусных антигенов (инфекционного вируса).Такое лечение позволит защитить как краткосрочный, так и долгосрочный иммунитет. Насколько нам известно, это первый отчет о работе, посвященной изучению использования или применимости адъювантов, совместно вводимых с живыми вакцинами в ч.у. ситуация.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

Штамм

ECTV Moscow (ATCC VR-1374), VACV-Lister (Elstree; предоставлен Министерством здравоохранения Израиля) и клональный изолят MVA F6 на 584 -м пассаже CEF размножали и титровали, как описано ранее [8].ECTV, экспрессирующая люциферазу светлячков (ECTV-Luc) [38], была любезно предоставлена ​​профессором Луисом Сигалом, Исследовательский институт онкологического центра Фокс Чейз, Филадельфия, США. Вкратце, ECTV Moscow и ECTV-Luc размножали в клетках HeLa (ATCC-CCL-2) и титровали на клетках BS-C-1 (ATCC-CCL-26). VACV-Lister размножали на хориоалантоисных мембранах эмбрионированных яиц и титровали на клетках Vero (ATCC-CCL-81). MVA размножали на вторичных фибробластах куриных эмбрионов и титровали на клетках BHK-21 (ATCC-CCL-10).

Эксперименты с заражением животных

Общие процедуры по уходу и содержанию животных соблюдались в соответствии с правилами проведения экспериментов на животных Израильского института биологических исследований (IIBR). Все протоколы экспериментов (M-45-2011, M-22-2012, M-52-2012 и M-05-2013) были одобрены IACUC (Институциональным комитетом по уходу за животными) МИБР до начала исследований. Были приложены все усилия, чтобы минимизировать страдания животных. Конечными точками были потеря веса (25% от исходного веса в инфицированных необработанных группах и 40% в обработанных группах) и / или неспособность реагировать на рефлекс выпрямления [39].Животных, достигших этих предопределенных конечных точек, гуманно приносили в жертву путем смещения шейных позвонков. Мышей взвешивали каждые 1–3 дня в течение первых двух недель, а затем каждые 2–5 дней до конца эксперимента (25–30-е сутки). Когда мышей теряли в весе более чем на 20%, проводилось взвешивание индивидуумов на ежедневной основе. Все заражения и обработки проводили однократно на анестезированных мышах (кетамин 75 мг / кг, ксилазин 7,5 мг / кг в PBS). Неинфицированные необработанные и инфицированные необработанные группы служили во всех экспериментах в качестве контроля.Обработка плацебо проводилась с PBS. Количество мышей в группе для каждого эксперимента указано в таблицах или в подписях к соответствующим рисункам. Мышей содержали в 12-часовом цикле свет-темнота, причем темновой цикл начинался с 19:00. до 7∶00 утра с ad libitum продовольствием и водой. Мышей содержали в особой среде, свободной от патогенов, в индивидуально вентилируемых клетках (IVC). Перед каждым экспериментом мышей случайным образом делили на экспериментальные группы по 3–6 животных для получения достоверных статистических данных.

Самок мышей BALB / c (возраст 6-8 недель, 15-18 граммов) были приобретены в Charles River Laboratories, Маргейт, Великобритания. Самок мышей C57BL / 6j (возраст 6-8 недель, 15-18 граммов) были приобретены в лаборатории Джексона (мыши JAX, Массачусетс). За неделю до эксперимента мышей акклиматизировали под наблюдением. Для интраназального (i.n.) заражения мышей анестезировали и вводили ECTV (20 мкл) путем закапывания в одну из ноздрей.

В экспериментах BALB / c контрольная доза варьировала от 4 до 20 ECTV LD 50 (1 БОЕ = 1 LD 50 ; всего 4 эксперимента), а у мышей C57BL / 6j контрольная доза варьировала от 2 до 3. ECTV LD 50 (250 БОЕ = 1 LD 50 ; всего 2 эксперимента).ECTV-Luc использовали для исследования биолюминесценции на мышах BALB / c. Мышей инфицировали 2 в / н. LD 50 (7 БОЕ = 1 i.n. LD 50 ), оставленная без лечения (n = 5) или обработанная поли (I: C) на 3 день р.э. (n = 3) и сканировали на 7, 8, 14 и 16 дни p.e.

Poly (I: C) (высокомолекулярный, InvivoGen, CA) и CpG-олигонуклеотиды ODN 1826 и ODN 1585 (типа B и A, соответственно; InvivoGen, CA) были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя, разделены на аликвоты и заморожены (-20 ° C) для дальнейшего использования.

Вакцинацию VACV-Lister (i.d. скарификация хвоста, 1 × 10 6 БОЕ в 10 мкл) или MVA (внутримышечно, 1 × 10 8 БОЕ в 50 мкл) проводили, как описано ранее [7]. Поли (I: C) вводили подкожно. у основания хвоста (100 мкг в 100 мкл). CPG-ODN 1826 и CPG-ODN 1585 вводили подкожно. на сайте i.d. скарификация хвоста (50 мкг в 10 мкл). Эти агонисты TLR вводили либо отдельно, либо одновременно с вакцинами.

Во всех случаях лечение было дано анестезированным мышам один раз в качестве единой обработки.

Приготовление сыворотки и определение вирусной нагрузки в органах мыши

Вирусные нагрузки ECTV в селезенке, печени и легких определяли у мышей в течение 8 дней p.e. как описано ранее [7]. У мышей брали кровь из хвостовой вены перед удалением органа, и сыворотку отделяли в пробирках для разделения (BD Microtainer, UK) после центрифугирования (10600 g) и держали при -20 ° C.

Биолюминесцентная визуализация

Получение изображений в реальном времени было выполнено с помощью системы IVIS Lumina II (Caliper LifeSciences, Массачусетс).Субстрат D-люциферина (Caliper LifeSciences, Массачусетс) вводили внутрибрюшинно (i.p.) (150 мкг / г веса тела) за 7 минут до визуализации. Мышей визуализировали под анестезией с использованием кетамина 75 мг / кг, ксилазина 7,5 мг / кг в PBS. Мышей получали изображения на 7, 8, 14 и 16 дни после операции. Изображения собирали в течение 1 или 40 с с коэффициентом объединения 4. Для всех исследуемых мышей использовали одну и ту же область интереса (ROI) для расчета интенсивности сигнала (от груди до задних конечностей). Излучение света измерялось в фотонах / с / см2 / ср (поток фотонов).Сбор и анализ были выполнены с помощью программного обеспечения Living Image, версия 4.2 (Calliper LifeSciences, Хопкинтон, Массачусетс).

Количественное определение IFN-γ и IFN-α

Концентрация IFN-γ в сыворотке измерялась через 8 дней p.e. с использованием набора Quantikine для мышиного IFN-γ для иммуноанализа в соответствии с инструкциями производителя (R&D Systems, MN) и как описано ранее [7]. Концентрации IFN-α в сыворотке (через 1 день после лечения или в соответствующие дни p.e. в инфицированной необработанной группе) измеряли с использованием набора VeriKine для ELISA мышиного IFN-α в соответствии с инструкциями производителя (PBL InterferonSource, NJ).

Определение титра антител IgM

Титры специфических IgM антител к осповакцине определяли у мышей, начиная с 8-го дня p.e. SERA с помощью ELISA. 96-луночные микротитрационные планшеты покрывали в течение ночи VACV WR (1 × 10 7 БОЕ / мл, 100 мкл / лунку, 4 ° C). Вирус инактивировали с использованием 3,7% параформальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре (50 мкл / лунку для конечной концентрации 2,4%) с последующими 3 промываниями в промывочном буфере (0,05% Tween 20 в PBS). Образцы в конечном разведении 1∶200 в TSTA (50 мМ Tris pH 7.6, 142 мМ NaCl, 0,05% азида, 0,05% Твин 20 и 2% БСА) добавляли в планшет на 1 час при 37 ° C после блокирования TSTA в течение 1 часа при 37 ° C. Конъюгированный с щелочной фосфатазой козий антимышиный IgM, разведенный 1-1000 в TSTA (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. PA), добавляли после 3 промывок и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. P- нитрофенилфосфатный субстрат (Sigma, Миссури) добавляли после 3 промывок и измеряли оптическую плотность (считывающее устройство для микропланшетов Spectramax 190, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, О.D. 405 нм) после 60 мин инкубации при комнатной температуре. Значения IgM определяли путем вычитания удвоенного значения буферной контрольной лунки из исследуемого образца.

Окрашивание поверхностных и внутриклеточных цитокинов

Спленоциты мыши окрашивали на внеклеточные маркеры с последующим внутриклеточным окрашиванием (ICS) с использованием набора Cytofix / Cytoperm, содержащего монензин (BD Biosciences, NC), в соответствии с инструкциями производителя. В качестве антител использовали анти-CD3ε (клон 145-2C11), анти-CD8α (клон 53-6.7), анти-CD4 (клон RM4-5), анти-DX5 (клон DX5) и анти-IFNγ (клон XMG 1.2, все от e-Bioscience). Сбор данных выполняли с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6 (Tristar, Калифорния). Общее количество клеток NK, CD3 + , CD4 + и CD3 + , CD8 + в селезенке определяли путем умножения процентного содержания каждого типа клеток на общее количество клеток, выделенных из органа.

Гистология и иммуногистохимия

Образцы тканей (легкие, селезенка и печень) фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 7–14 дней, переносили в 70% этанол, заливали парафином, делали серийные срезы (толщиной 5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E ).Для обнаружения ECTV срезы после извлечения антигена (10 мМ цитратный буфер, 0,05% Tween-20, pH 6,0 в течение 20 минут при 95–100 ° C) обрабатывали в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем, с использованием наших собственных кроличьих антибиотиков. Антитело -ECTV, разведенное 1-250 в PBS + 1% BSA (EnVision + System-HRP (DAB) для использования с первичными антителами кролика, DAKO, Carpinteria, CA). Окрашивание CD45 выполняли с использованием биотинилированного крысиного антитела против CD-45 мыши (R&D systems, MN) после извлечения антигена. Набор для окрашивания клеток и тканей для крыс, систему HRP-DAB использовали для усиления сигнала (R&D systems, MN).Контркрашивание гематоксилином проводилось на всех предметных стеклах.

Анализ данных

графиков выживаемости Каплана-Мейера сравнивали с помощью теста Кокса-Мантеля. Анализ заболеваемости проводился как среднее значение площади под кривой (AUC) в процентах от индивидуального веса на исходном уровне, как описано ранее [40]. Вкратце, AUC была взвешена с продолжительностью периода наблюдения, начиная со дня заражения (день 0) до конца эксперимента (день 25-30) или дня смерти животного.Различия между группами анализировали с помощью теста Стьюдента t . Для сравнения данных вирусной нагрузки между группами был проведен анализ Манна-Уитни. Летальная доза 50% для мышей BALB / c и C57BL / 6j была рассчитана согласно Reed et. al. [41]. Сообщенные значения p <0,05 считались значимыми. На протяжении всей рукописи средние данные представлены как среднее значение (± стандартная ошибка среднего (SEM)). Для корреляции IFNγ - вирусная нагрузка использовалась линейная регрессия, тогда как для корреляции IFNγ - IgM была проведена нелинейная аппроксимация по экспоненциальной кривой роста.Статистические данные были выполнены с использованием GraphPad Prism 5 для Windows (версия 5.00, GrapPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Результаты

Расширение терапевтического окна постконтактной вакцинации путем совместного введения агонистов TLR3 и TLR9

Чтобы оценить способность агонистов TLR9 и TLR3 увеличивать терапевтический потенциал вакцинации после контакта, мы использовали установленную модель инфекции ECTV на мышах [7], [10], [11]. Мыши BALB / c, инфицированные смертельной дозой ECTV, демонстрировали признаки болезни (потеря веса (рис. 1 A), опушение шерсти) начиная с 7-8 дней.е. и умерли от инфекции в течение среднего времени до смерти (MTTD) 11,3 ± 3,4 дня. Мыши, получавшие плацебо (PBS), умерли от инфекции так же, как и инфицированная необработанная группа (MTTD 10,7 ± 1,2 и 11,2 ± 2,7 на 2-й и 3-й день соответственно). В этих условиях вакцинация VACV-Lister не защищала мышей (таблица 1, 8% на 2-й день и 0% на 3-й день p.e., Рисунок 1 C, D). Совместное введение агонистов TLR9, CpG 1826 (тип B) или CpG 1585 (тип A) с вакциной на 2-й или 3-й день после операции. обеспечивает значительную защиту (Таблица 1, Рисунок 1 A, B).Введение CpG 1585 без вакцины обеспечивало частичную защиту, в то время как введение CpG 1826 не было защитным (таблица 1, фигура 1 A, B).

Рис. 1. Заболеваемость, основанная на изменении веса после лечения мышей BALB / c после воздействия (р.э.).

Мышей инфицировали 4–20 i.n. ЭЦТВ ЛД 50 . (A, B) Лечение CPG с или без VACV-Lister на 2 (A) и 3 (B) день (C) Обработка поли (I: C) с использованием или без VACV-Lister или только VACV-Lister на 2 день p.e.(D) Обработка поли (I: C) с использованием VACV-Lister или MVA или без них и только лечение вакцинами на 3 день p.e. (E, F) Обработка поли (I: C) с или без VACV-Lister или MVA и только MVA в дни 4 (E) и 5 ​​(F) p.e. Звездочка обозначает значительную разницу в площади под кривой изменения веса на протяжении всего эксперимента для обработанных групп по сравнению с инфицированной необработанной группой (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, * *** P <0,0001, т -тест). Показан сбор данных для каждого лечения (изменение веса (среднее значение, стандартная ошибка)).Показана заболеваемость инфицированных необработанных мышей из соответствующих релевантных экспериментов. Количество мышей, погибших от инфекции в каждый момент времени, выделено цветом в рамке над каждым графиком. Выжившие из общего числа мышей в каждой группе обозначены цветом рядом с легендой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g001

Затем мы оценили защитный эффект агониста TLR3 (РНК) поли (I: C). Совместное введение поли (I: C) с вакциной предотвратило смерть 83%, 89%, 80% или 67% мышей, получавших лечение на 2, 3, 4 или 5 дни, соответственно (P <0.0001 на 2, 3, 4 дни и P <0,01 на 5 день по сравнению с инфицированными необработанными мышами, таблица 1). Интересно, что введение поли (I: C) без вакцины также предотвратило смерть (67%, 83% или 100% мышей на 2, 3 или 4 дни соответственно (P <0,05 на 2 день и P <0,0001 на 3 день). и 4 по сравнению с инфицированными необработанными мышами)), однако статистически значимая защита на 5 день была достигнута только тогда, когда поли (I: C) был объединен с вакциной. Подобно лигандам TLR9, показатели смертности отражали степень заболеваемости.Обработка поли (I: C) препаратом VACV-Lister, назначенная на 2, 3, 4 или 5 день, отсрочила и значительно уменьшила степень потери веса (P <0,0001 для 2, 3, 4 дней и P <0,05 для дня). 5, рис. 1 C – F)).

В отличие от VACV-Lister, MVA не реплицируется в млекопитающих-хозяевах, что, с одной стороны, делает MVA безопасной вакциной, но с другой стороны, требует 100-кратного увеличения дозы вакцины. Чтобы оценить эффективность совместного введения поли (I: C) и MVA, мышей BALB / c р.э. вакцинированы MVA (1 × 10 8 БОЕ i.м) с поли (I: C) (s.c.) или без него. Вакцинация MVA 3 дня р.э. защищали 45% мышей, в то время как вакцинация в дни 4 или 5 больше не обеспечивала защиты (Таблица 1, 0% на 4 день и 8% на 5 день, Рисунок 1 D – F). Совместное введение поли (I: C) и MVA улучшило защиту до 100%, 53% и 33% на 3, 4 и 5 дни соответственно (P <0,0001 для 3-го дня, P <0,05 для 4-го дня и P = 0,3. на 5-й день по сравнению с инфицированными, не получавшими лечения). Совместное защитное введение MVA и поли (I: C) снизило заболеваемость по сравнению с незащищенными мышами (P <0.0001, P = 0,08 и P = 0,4 для 3, 4 и 5 дней соответственно; Рисунок 1D – F). Совместное введение поли (I: C) и MVA не имело преимуществ перед поли (I: C) (таблица 1, рисунок 1).

Аналогичные эксперименты были выполнены с мышами C57BL / 6j, которые отличаются от BALB / c по чувствительности к инфекции ECTV (i.n. LD 50 в BALB / c составляет 1 БОЕ, а в C57BL / 6j — 250 БОЕ). Мышам вводили 2–3 внутривенных инъекций. LD 50 ECTV (MTTD инфицированных необработанных: 11,2 ± 1,9 дня) и обработанных в дни 0, 1 или 2 p.е. В то время как VACV-Lister не защищал ни в день 0, ни в день 1, комбинация поли (I: C) и VACV-Lister обеспечивала значительную защиту (выживаемость 55% и 45% в дни 0 и 1, P <0,0001 в обоих случаях). случаев по сравнению с инфицированными необработанными мышами, таблица 2). Совместное введение поли (I: C) и MVA в течение одного или двух дней p.e. также улучшило защиту по сравнению с защитой, достигнутой только с помощью MVA (день 1 с 72% до 100%; день 2 с 18% до 55%). Совместное защитное введение поли (I: C) и VACV-Lister или MVA не предотвращало ухудшения заболеваемости в течение первых 10 дней p.е. но предотвратил дальнейшее ухудшение состояния и смерть (рис. S1, P <0,01 для VACV-Lister + poly (I: C) и P <0,001 для MVA + poly (I: C) на основании анализа AUC по сравнению с инфицированными, не получавшими лечения или только вакцинированными). Введение только поли (I: C) в день 1 p.e. защищали 43% мышей (P <0,0001 по сравнению с инфицированными необработанными мышами).

Соотношение эффективных методов лечения со снижением вирусной нагрузки на периферические органы

Для дальнейшей разработки механизма защиты, обеспечиваемой адъювантами, мы оценили эффект поли (I: C) на in-vivo диссеминация ECTV.Мышей BALB / c инфицировали интраназально летальной дозой ECTV, экспрессирующей люциферазу светлячка (ECTV-Luc, 2 LD 50 ), и поток фотонов определяли с использованием устройства для визуализации биолюминесценции (IVIS Lumina II). Анализ данных показал, что в течение 7-8 дней ECTV-Luc эффективно распространяется в легкие, печень и селезенку, определяемую как область интереса (ROI) (рис. 2 A). Биолюминесцентный анализ на 7, 8 дни (рис. 2 Б), 14 и 16 п.э. (Рисунок 2 C) показал, что обработка поли (I: C) на 3-й день значительно снижает интенсивность сигнала в области интереса на 2–3 log по сравнению с сигналом у инфицированных необработанных мышей (Рисунок 2 D, P <0.05 в течение 7 и 8 дней) в соответствии с улучшенной защитой, индуцированной поли (I: C) у мышей, инфицированных ECTV-Moscow (Таблица 1). Восстановление после лечения поли (I: C) (день 16 pe, рис. 2 C) было связано с увеличением веса, улучшением состояния животных и неопределяемым вирусом в селезенке (<75 БОЕ / селезенка) и печени (<750 БОЕ / печень). . Несмотря на то, что биолюминесцентный сигнал от легкого не определялся через 16 дней, очень низкая вирусная нагрузка 4,9 × 10 3 ± 3,0 × 10 3 БОЕ / легкое все же была обнаружена с помощью анализов бляшек (рис. 2 D).

Рис. 2. Влияние обработки Poly (I: C) на распространение вируса, оцененное с помощью in-vivo биолюминесцентных изображений.

Мышей BALB / c инфицировали 2 i.n. ECTV-Luc LD 50 и оставлено без лечения (n = 5) или обработано поли (I: C) на 3 день p.e. (n = 3). (A) Зараженные нелеченые мыши 8 дней р.е. (B) Зараженные мыши, получавшие лечение на 3 день р.э. с поли (I: C) и изображение на 8-й день p.e. (C) Группа, обработанная Poly (I: C), на 3 день p.e. снято на 16 день р.э. Биолюминесцентные изображения были получены с использованием диафрагмы 1, коэффициента объединения 4 и времени получения 1 сек (A, B) или 40 секунд (C).Выражение относительного потока фотонов представлено псевдоцветной тепловой картой. (D) Заболеваемость, основанная на изменении веса (линии, левая ось Y) и сигнале биолюминесценции на 7, 8, 14 и 16 дни p.e. (столбцы, правая ось Y) групп, показанных на панелях A – C (красный для инфицированных, не получавших лечения, черный для поли (I: C), обработанных на 3 день p.e.). Интенсивность биолюминесцентного сигнала как общий поток фотонов (фотон / с / см2 / ср) рассчитывалась путем анализа области интереса (ROI) на груди и области живота, отмеченной белым квадратом на правой мыши на панели (A).Для всех исследованных мышей использовалась одинаковая ROI. Звездочка означает значительное снижение потока фотонов (n = 3–5 в каждой группе, P <0,05). Кинжал олицетворяет мертвых мышей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g002

Для дальнейшей оценки эффективности лечения мышей BALB / c умерщвляли на 8 день p.e. и вирусные нагрузки в легких, печени и селезенке. В периферических вторичных органах вирусная нагрузка в зараженной нелеченой группе достигала 2.9 × 10 7 БОЕ / печень и 2,0 × 10 8 БОЕ / селезенка (Geomean, рисунок 3 A, C). Вакцинация VACV-Lister 2 или 3 дня р.э. не оказали влияния на вирусную нагрузку, обнаруженную в селезенке или печени (рис. 3 A – D). Лечение поли (I: C), проводимое с вакцинацией VACV-Lister или без нее на 2-й день p.e. значительно снизили вирусную нагрузку в печени и селезенке (P <0,05 по сравнению с инфицированной нелеченой группой). Это снижение было дополнительно усилено, когда лечение Poly (I: C) проводилось на 3-й день. Корреляция между защитой и сниженной вирусной нагрузкой в ​​селезенке и печени была также обнаружена после совместного введения вакцины VACV-Lister и CpG 1826, введенного в день. 2 или 3 (Рисунок 3 A – D).Ни один из упомянутых выше методов лечения не снизил вирусную нагрузку в легких (рис. 3 E – F). Аналогичные результаты были получены на мышах C57BL / 6j (рис. S2).

Рис. 3. Вирусная нагрузка после обработки после контакта.

Вирусную нагрузку определяли с помощью анализа бляшек у мышей BALB / c через 8 дней после контакта (p.e.) после заражения 18 i.n. ЭЦТВ ЛД 50 . (A, C, E) вирусная нагрузка в печени, селезенке и легких мышей, получавших лечение на 2 день p.e. (B, D, E) вирусная нагрузка в печени, селезенке и легких мышей, получавших лечение на 3-й день p.е. Горизонтальные линии представляют собой среднее геометрическое для каждой группы. Обозначены выживаемость каждой группы. Звездочка означает значительное снижение вирусной нагрузки (n = 3 в каждой обработанной группе) по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 6, P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g003

Эффективное лечение поли (I: C) коррелирует со снижением уровня IFNγ в сыворотке на поздних стадиях заболевания и предотвращением повреждения тканей

После летального заражения приматов вирусом натуральной оспы уровень IFN-гамма (IFNγ) повышается на поздних конечных стадиях болезни примерно на 3 порядка по сравнению с уровнем цитокинов у наивных животных [42].Мы количественно определили уровень IFNγ в сыворотке мышей BALB / c, собранной на 8 день p.e. В этот момент инфицированные нелеченые мыши находились на поздних стадиях заболевания, что зависело от их потери веса и вирусной нагрузки в различных органах. В то время как сывороточный уровень IFNγ у наивных мышей составлял 11,9 ± 1,0 пг / мл, у инфицированных необработанных мышей BALB / c уровни IFNγ достигали 77 800 ± 13 000 пг / мл (рис. 4 A). Подобные уровни были также обнаружены у инфицированных мышей, вакцинированных VACV-Lister или обработанных плацебо. Введение поли (I: C) на 3-й день р.е., либо отдельно, либо с вакциной, которая обеспечивала защиту 83% и 89% соответственно, приводила к значительному снижению уровня IFNγ (2461 ± 957 пг / мл для VACV-Lister + poly (I: C) и 4 166 ± 1135 пг / мл только для поли (I: C), фиг. 4 A, P <0,01 по сравнению с инфицированной необработанной группой).

Рис. 4. Изменения уровней IFNγ в сыворотке после р.э. лечения.

Уровни IFNγ определяли через 8 дней p.e. (A) Мышей BALB / c инфицировали 5–18 i.n. ECTV LD 50 и лечили на 3 день р.е. с VACV-Lister (n = 6), VACV-Lister и Poly (I: C) (n = 6), Poly (I: C) (n = 6) или плацебо (PBS, n = 3). Звездочка указывает на значительную разницу (P <0,05, n = 9 в инфицированной необработанной группе). (B) Мышей C57BL / 6j инфицировали 2–3 вв. ECTV LD 50 и лечение в дни 0–2 p.e. с Poly (I: C) с VACV-Lister или MVA или без них и только вакцинами (n = 3–6 в каждой группе). Звездочка указывает на значительную разницу в уровнях IFNγ по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 9, P <0.05). Для каждой экспериментальной группы значения процента защиты обозначены над каждой полосой (%), которые относятся к данным, собранным для всех аналогичных групп обработки (таблицы 1 и 2). Наивные мыши BALB / c (n = 5) и C57BL / 6j (n = 4) имели значения IFNγ 11,9 ± 1,0 пг / мл и 8,0 ± 0,8 пг / мл соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g004

Анализ IFNγ у мышей C57BL / 6j выявил поведение, аналогичное BALB / c, но при этом величина ответа (изменения IFNγ) на инфекцию ECTV и к защитному лечению был более устойчивым у мышей BALB / c (рис. 4 B).Комбинированное лечение VACV-Lister или MVA с поли (I: C), а также введение только поли (I: C) было связано со снижением уровней IFNγ в соответствии с улучшенной выживаемостью.

Уровни IFNγ в сыворотке на 8 день pe положительно коррелировали с вирусной нагрузкой в ​​селезенке и печени для каждой линии мышей в обеих линиях мышей (Рисунок 5 A – D, лечение на 2–3 дни; R 2 указаны рядом с каждым графиком, P <0,0001 во всех случаях). С другой стороны, на вирусную нагрузку в легких лечение не повлияло, и, следовательно, уровни IFNγ в сыворотке не коррелировали с вирусной нагрузкой в ​​легких (рис. 5 E, F).Кроме того, распределение диапазона IFNγ у мышей BALB / c было шире, чем у C57BL / 6j, что позволило определить пороговые значения, которые могут позволить различать успешный (<700 пг / мл) и неэффективный (> 100000 пг / мл). мл) лечение.

Рис. 5. Корреляция между IFNγ и вирусной нагрузкой.

(A, C, E) Вирусная нагрузка и уровни IFNγ у мышей BALB / c, инфицированных 18 i.n. ECTV LD 50 , необработанные (n = 6) или однократно обработанные на 2 или 3 день: поли (I: C) с или без VACV-Lister, CpG-ODN 1585 и 1826 с или без VACV-Lister и VACV- Только листер (n = 3 / группа).(B, D, F) Вирусная нагрузка и уровни IFNγ у мышей C57BL / 6j, инфицированных 2–3 i.n. ECTV LD 50 , необработанные (n = 6) или однократно обработанные в день 0: поли (I: C) с или без VACV-Lister, VACV-Lister или плацебо; день 1: поли (I: C) с или без VACV-Lister или MVA, VACV-Lister или MVA, плацебо; день 2: поли (I: C) с или без MVA (n = 3 / группа), MVA или плацебо (n = 3 / группа). (А, В) селезенки; (C, D) печень и (E, F) легкие. Зеленые точки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость составляла 50% и выше.Красные точки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость была менее 50% (n = 48 либо для BALB / c, либо для C57BL / 6j).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g005

Для изучения патологического воздействия инфекции на органы-мишени мы провели гистопатологическое исследование селезенки, печени и легких леченых (на 3-й день) vs. инфицированные нелеченые мыши на 8-й день Селезенки инфицированных необработанных мышей (или мышей, получавших только VACV-Lister) демонстрировали серьезное разрушение ткани и полную потерю структуры ткани.Белая пульпа была в основном разрушена, и по всей селезенке наблюдались некроз лимфоцитов и наличие кариорексиса (рис. 6 A, D). Лимфоциты (положительно окрашенные на CD45) появились в остатках белой пульпы (рис. 6 B, E), тогда как иммуногистохимические срезы были положительно окрашены на вирусные антигены ECTV по всей некротической ткани (рис. 6 C, F). Напротив, селезенки мышей, получавших комбинированное лечение поли (I: C) — VACV-Lister, показали нормальную морфологию, которая сопровождалась типичной архитектурой белой пульпы (положительно окрашенной CD45) и неопределяемыми вирусными антигенами (рис. 6 G – I). ).Селезенки мышей, получавших поли (I: C), имели ту же морфологию, что и в группе комбинированного лечения (рис. 6 I – L), за исключением нескольких небольших некротических очагов, которые были положительными для вирусных антигенов и отрицательными для клеток CD45 (рис. S3).

Рисунок 6. Эффект п.э. обработки селезенки инфицированных мышей.

Селезенки вскрывали через 8 дней р.э. от обработанных мышей (через 3 дня после лечения) (A – C, G – L), от необработанных (D – F) или от незараженных наивных мышей (M – O). Левый столбец — окраска гематоксилином и эозином (H&E), средний столбец — CD45 (коричневое окрашивание лейкоцитов), правый столбец — вирусные антигены (коричневое окрашивание).Серийные разделы (A – C) лечения VACV-Lister; (D – F) инфицированные без лечения; (G – I) лечение поли (I: C) и VACV-Lister и (J – L) лечение поли (I: C). Увеличение на всех изображениях: X40.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g006

Гистопатологическое исследование также проводилось на печени обработанных и необработанных мышей. В то время как у мышей, получавших комбинированный VACV-Lister — поли (I: C) и поли (I: C), наблюдалась только легкая или умеренная диффузная гепатоцитарная вакуолярная дегенерация, у инфицированных необработанных мышей и мышей VACV-Lister в печени наблюдалась мультифокальная гепатоцитарная активность. некротические очаги по всей печени и массивное окрашивание на ECTV (Рисунок S4).Легкие мышей, получавших только поли (I: C) или комбинированные с VACV-Lister, имели нормальную морфологию ткани, в то время как легкие признаки интерстициальной пневмонии наблюдались в легких инфицированной необработанной или только группы, обработанной VACV-Lister. В группе, получавшей Lister, в легких было обнаружено повышенное количество нейтрофилов (данные не показаны).

Модуляция адаптивного иммунного ответа после введения Poly (I: C)

Продемонстрировав, что пролиферация и распространение ECTV на органы-мишени снижается после введения поли (I: C), мы дополнительно исследовали влияние лечения на иммунный ответ.Введение поли (I: C) на 2-й или 3-й день после операции индуцировало более высокие уровни специфических IgM к поксвирусу в сыворотке мышей BALB / c при измерении через 8 дней после каждого дня. (Рисунок 7A, P <0,01 по сравнению с инфицированной необработанной группой) независимо от того, вводили ли VACV-Lister одновременно. Титры IgM были ниже предела обнаружения у инфицированных необработанных, обработанных плацебо или вакцинированных VACV-Lister мышей. Твердая защита (67% и выше) была связана с высоким титром антител IgM.

Рисунок 7. Корреляция уровней IgM и эффективности лечения.

(A) Уровень IgM в сыворотке мышей BALB / c, собранных через 8 дней после внутривенного введения. инфицирование 18 LD 50 ECTV определяли с помощью ELISA. Пропорции выживаемости каждой группы указаны над каждой полосой. Звездочка обозначает значимое различие по сравнению с инфицированной необработанной группой (P <0,01, n = 6 в инфицированной необработанной группе, n = 3 в обработанных группах, t -тест). Пунктирная линия обозначает предел обнаружения. (B) Корреляция между уровнями IFNγ и IgM у мышей, представленных на панели A.Зеленые кружки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость составляла 50% и выше. Красные треугольники — обследованы мыши из групп, в которых выживаемость была менее 50%. Значение R 2 представляет собой нелинейную подгонку.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g007

Поскольку известно, что продукция IFNγ отменяет выработку иммуноглобулинов (включая IgM, [43], [44]), мы исследовали, наблюдаемые изменения в ответе IgM коррелировали с уровнем IFNγ (оба обследованы с 8 дня р.е. сыворотки мышей). Действительно, мы обнаружили, что высокие уровни IFNγ отрицательно коррелировали с титрами специфических IgM к поксвирусу (фигура 7 B, R 2 = 0,71).

Для дальнейшей характеристики клеточно-иммунного ответа после п.э. Адъювантное введение, мышей BALB / c инокулировали летальной дозой ECTV (4LD 50 ), вводили поли (I: C) на 3-й день, и эффект количественно оценивали на основе количества и активации естественных киллеров (NK) как а также CD4 + и CD8 + Т-клетки на 8 день р.е. (т.е. через 5 дней после лечения). Гросс-морфологическое сравнение выявило увеличенные селезенки у инфицированных мышей, получавших поли (I: C), с VACV-Lister или без него, в то время как селезенки инфицированных мышей, вакцинированных VACV-Lister или оставленных без лечения, выглядели меньше и имели мозаичный негомогенный вид в в отличие от селезенки мышей, которым вводили поли (I: C), которая выглядела нормальной (фигура 8 A). Действительно, количество общих лимфоцитов в относительно меньших селезенках было ниже, чем в селезенках наивных мышей, тогда как обработка поли (I: C) коррелировала с увеличением количества лимфоцитов в селезенке (фигура 8 B).Уменьшение общего количества лимфоцитов сопровождалось уменьшением количества NK-клеток, CD3 + CD4 + и CD3 + CD8 + Т-клеток. (Рисунок 8C, E, G соответственно). Напротив, обработка поли (I: C) привела к увеличению количества NK-клеток (фигура 8 C). Дальнейший анализ активации лимфоцитов показал, что обработка поли (I: C) индуцировала активацию NK-клеток, CD3 + CD8 + и CD3 + CD4 + Т-клеток, как показано внутриклеточным окрашиванием на IFNγ (фиг. 8 D, F, H).В то время как активация лимфоцитов у мышей, получавших поли (I: C), включала как CD4, так и CD8 T-клетки, а также NK-клетки, необработанные мыши или мыши, вакцинированные VACV-Lister, демонстрировали дифференциальную активацию только CD3 + CD8 + T-клеток. Таким образом, прочная защита была связана с организованной активацией клеток CD3 + , CD8, + , NK и CD3 + , CD4, + .

Рисунок 8. Клеточно-иммунный ответ после п.э. лечение.

Мышей BALB / c инфицировали 4 i.п. ECTV LD 50 , не лечили или лечили на 3 день р.э. и их селезенки были сфотографированы (A) и проанализированы с помощью проточной цитометрии на распределение и активацию (внутриклеточный IFNγ) различных популяций клеток. (B) Подсчет жизнеспособных лимфоцитов проводился под световым микроскопом. (C – H) Количество общих и активированных клеток различных популяций клеток: NK (C, D), CD3 + CD4 + (E, F) и CD3 + CD8 + (G, H) клетки соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g008

Poly (I: C) способствует защите посредством TLR3 и индукции IFNα типа 1

Связывание поли (I: C) с TLR3 приводит к активации рецептора и синтезу IFN типа I. Чтобы оценить противовирусный иммунный ответ после введения поли (I: C), мы количественно оценили влияние введения поли (I: C) на продукцию IFNα путем измерения его концентрации в сыворотке неинфицированных наивных мышей. Введение поли (I: C) привело через 24 часа к значительному увеличению уровня сывороточного IFNα на три порядка (888.1 пг / мл против 8,5 пг / мл, P <0,01, рис. 9 A, вставка).

Рисунок 9. Повышение уровней IFN-α после введения Poly (I: C).

Уровни

IFN-α исследовали в сыворотке мышей BALB / c. (Вставка) Сыворотки неинфицированных наивных мышей до (n = 2) и через 24 часа после введения поли (I: C) (n = 6). IFN-α в сыворотке 20 i.n. LD 50 Необработанных мышей, инфицированных ECTV (A), обследовали в дни 4 (n = 6), 5 (n = 3) или 6 (n = 3) p.e. или через 24 часа после лечения препаратом VACV-Lister, введенным на 3-й день, MVA на 3-й, 4-й или 5-й день или плацебо на 3, 4 или 5 дни (n = 3 во всех группах).(B) IFN-α в сыворотке мышей через 24 часа после обработки поли (I: C) на 3, 4 или 5 дни отдельно или в комбинации с VACV-Lister или MVA (n = 3-5 / группа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g009

Поскольку инфекция ECTV влияет на иммунитет хозяина, включая ответ IFN типа I [37], мы определили уровни IFNα в сыворотке крови у инфицированных мышей после лечения 3, 4 или 5 дней pe (Рисунок 9 A, B). Уровень IFNα оставался низким (<54 пг / мл) у мышей, инфицированных ECTV, которые не получали лечения или вакцинировались VACV-Lister или MVA (фигура 9 A).Напротив, введение поли (I: C) с вакцинами или без них приводило к повышенным уровням IFNα в диапазоне от 310 до 2660 пг / мл (фиг.9 B). Обработка поли (I: C) с вакциной или без нее, вводимая на 3-й день p.e. индуцировал значительно более высокие уровни IFNα по сравнению с инфицированной необработанной группой в тот же момент времени (день 4 p.e., P <0,01, фиг.9 A, B). Совместное введение VACV-Lister или MVA поддерживало способность поли (I: C) индуцировать IFNα. Индукция IFNα была связана с улучшением статистической выживаемости в этих группах (таблица 1).Прогрессирование заболевания препятствовало способности поли (I: C) индуцировать IFNα, что приводило к снижению ответа IFNα на 4 или 5 день по сравнению с 3 днем ​​(фигура 9 B).

Наконец, мы исследовали, достаточно ли индукции IFNα поли (I: C) для защиты мышей от последующей инфекции ECTV. С этой целью мышам вводили поли (I: C) за день до или в день воздействия (20 ECTV i.n. LD 50 ). Во время этих ранних обработок защиты не было. Обработка поли (I: C) в этом эксперименте, проведенная на 1, 2 или 3 день, обеспечивала защиту 50%, 83% и 100% соответственно (данные не показаны), что позволяет предположить, что для эффективной защиты требуется согласованный эффект иммуномодуляции поли (I: C) в сочетании с достаточным количеством вирусных антигенов.

Обсуждение

Успех искоренения оспы позволил постепенно прекратить всемирную кампанию вакцинации, что привело к постепенному увеличению доли незащищенного населения. Таким образом, в случае случайного или преднамеренного высвобождения VARV потребуется быстрое и эффективное лечение, которое могло бы быть своевременно предоставлено как можно большему количеству людей. Оспа у людей связана с длительным инкубационным периодом (7–17 дней при естественных инфекциях), что дает время для p.е. вакцинация или лечение. Основываясь на нашем опыте на мышах, чем дольше инкубационный период, тем лучше эффект лечения и темпы выздоровления [8].

В этом отчете мы представили эффект агонистов TLR на терапевтическое окно p.e. вакцинация против оспы у мышей. После инфекции врожденная иммунная система обеспечивает хозяину первую линию защиты, за которой следует адаптивный иммунный ответ. Этот быстрый врожденный ответ объясняется, среди прочего, обнаружением чужеродных компонентов TLR, что приводит к активации различных путей, включая противовирусный иммунитет, стимуляцию Т-клеток и усиление сигналов воспаления [15], [17].Поксвирусы разработали множество стратегий для подрыва / вмешательства в иммунный ответ хозяина (обзор [37]). Недавно мы показали, что активная вакцинация до 3 дней р.э. обеспечивают эффективную защиту, требующую использования высокой дозы вакцины (1 × 10 8 БОЕ у мышей) [8]. Это исследование также продемонстрировало, что, хотя это и не требуется, путь IFN типа I (передача сигналов IFNAR) играет роль в защите от p.e путем вакцинации. Кроме того, Самуэльсон и ее коллеги продемонстрировали, что TLR9 не требуется, но играет роль в p.е. защита с помощью активной вакцинации против ECTV [36].

Эти факты побудили нас изучить влияние на иммунный ответ активации двух TLR; TLR3 и TLR9 с использованием их синтетических агонистов (синтетических молекул двухцепочечной РНК и бактериальной ДНК CpG соответственно). В то время как адъюванты обычно добавляют к инактивированным или субъединичным вакцинам для придания предэкспозиционного иммунитета [32], [45] — [47], в настоящем исследовании мы вводили адъювант совместно с живой вакциной и исследовали его как терапевтическое средство. .е. лечение. Действительно, однократная обработка VACV-Lister и поли (I: C) обеспечила надежную защиту даже на 5-й день после операции. в то время как лечение только VACV-Lister (при обычной низкой дозе вакцины) было эффективным только до 1 дня p.e. (Таблица 1, [8]). В текущем исследовании агонист TLR3 Poly (I: C) обеспечивает лучшую защиту, чем агонисты TLR9. Это может отражать главную роль TLR3 в защите от ECTV и / или более высокую эффективность поли (I: C) по сравнению с ODN в активации иммунного ответа.Поксвирусы кодируют множество иммуномодуляторов, которые, как известно, мешают противовирусному иммунному ответу [37]. Мы не рассматривали, подавляется ли противовирусный иммунный ответ после введения ДНК (ODN) механизмами уклонения от иммунитета, кодируемыми ECTV, более эффективно, чем противовирусная активность, направленная против дцРНК.

После введения поли (I: C) была обнаружена глубокая активация ответа IFN типа 1 (IFNα) с последующей активацией гуморального и клеточного иммунитета.В значительной степени IFNα не индуцировался инфекцией ECTV, что позволяет предположить, что иммунное уклонение от ECTV может препятствовать индукции IFNα. Даже п.э. вакцинация VACV или MVA не приводила к активации IFNα, что еще раз подтверждает идею о том, что инфекция ECTV эффективно блокирует индукцию ответа IFN типа 1. Способность ECTV снижать уровень IFNα продемонстрирована на Фигуре 9B, показывающей, что отсрочка введения поли (I: C) с 3 по 5 день приводит к снижению ответа IFNα. Действительно, EVM166 из ECTV, ортолог B18R растворимого IFN-связывающего белка типа 1, эффективно связывает и исключает мышиный IFN типа 1 из кровотока, что способствует вирулентности ECTV [48].В дополнение к ECTV, вакцинные штаммы (Lister и MVA), использованные в этом исследовании, также кодируют ортологи B18R, однако в p.e. В сценарии вакцинации эффект B18, кодируемого VACV-Lister или MVA, вероятно, маскируется EVM166. Ранее мы продемонстрировали путем вакцинации мышей с нокаутом IFNAR [8], что в отсутствие рецептора IFN α / β вакцинация MVA является защитной, но мыши теряют больше веса, чем родительский штамм (C57BL / 6j), что указывает на то, что при По крайней мере, MVA может вызывать защитный ответ IFN 1 типа, даже если EVM166 функционирует.В настоящем исследовании п.э. вакцинация VACV-Lister или MVA в сочетании с поли (I: C) не могла ослабить иммуносупрессию, вызванную ECTV на поздних стадиях заболевания. (Рисунок 9 B). Это ясно демонстрирует преимущество совместно вводимого поли (I: C), которое даже на поздних стадиях заболевания (например, 5-й день) индуцирует достаточное количество IFNα, которое ускользает от связывания вирусных IFN-связывающих белков и составляет защитный иммунитет. В дополнение к растворимым IFN-связывающим белкам поксвирусы кодируют множество белков, которые мешают пути IFN на нескольких уровнях, что может эффективно мешать IFN-ответу 1 типа [37].

Интересно, что умирающие мыши с высокой вирусной нагрузкой в ​​легких, селезенке и печени, которые в конечном итоге умирают от инфекции, имели значительно более высокий уровень сывороточного IFNγ, чем мыши, которые получали защитную терапию (поли (I: C) +/- вакцина; рисунки 3-5 ). Секреция IFNγ, в основном активированными NK- и T-клетками, выполняет иммунорегулирующие функции, включая активацию макрофагов и нейтрофилов, усиление активности уничтожения NK-клеток, регуляцию B- и T-клеточного ответа на антигены, стимуляцию специфических цитотоксических T-клеток, продвижение хемокина. и экспрессия цитокинов, а также вклад в защиту от вирусного патогенеза [49] — [51].Действительно, воздействие вируса, которое обеспечивает защитный иммунитет (например, воздействие кожного поксвируса у мышей), приводит к временной индукции ответа IFNγ [7], [52]. Однако при интраназальном летальном воздействии устойчивый и устойчивый ответ IFNγ выявляется на поздних стадиях заболевания, коррелирующих с патологическим повреждением тканей и смертью. Эта высокая концентрация IFNγ оказывает ингибирующее действие на адаптивный иммунный ответ [43], [44], что демонстрируется значительным ингибированием продукции IgM (рис. 7).Действительно, феномен высокой концентрации IFNγ, связанный с патологическим повреждением тканей на поздних стадиях заболевания, называемый «цитокиновый шторм», был описан Jahrling et al. у приматов, инфицированных VARV [42]. Линейная корреляция между повышенным уровнем сывороточного IFNγ и вирусной нагрузкой была продемонстрирована также у мышей, инфицированных RSV [53], что дополнительно указывает на то, что индуцированный IFNγ ответ может быть связан либо с защитным иммунитетом, либо с иммунной патологией в зависимости от времени и контекста заболевания.Холечек эт. al. [54] недавно сообщил, что п.э. вакцинация с помощью VACV, экспрессирующего IFNγ, защищает мышей от инфекции VACV и ECTV и объясняет защиту ранней экспрессией мышиного IFNγ, как обсуждалось выше. Поскольку явная поздняя экспрессия IFNγ может быть патологической, в то время как ранняя экспрессия имеет защитное значение, терапевтическое использование IFNγ следует рассматривать с использованием моделей временного, а не конститутивного дефицита IFNγ. На основании данных, представленных в этой работе, будет интересно оценить рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий IFNα в качестве внутреннего адъюванта для p.е. лечение, которое недавно было проведено с IFNγ. Эффективность лечения повторяющимися дозами IFNα и IFNγ против вирусов осповакцины и оспы обезьян у мышей дополнительно указывает на терапевтический потенциал модуляции иммунного ответа при лечении ортопоксвирусных инфекций [49], [55].

После защитной обработки (поли (I: C) +/- вакцина) вирусные нагрузки в селезенке и печени были значительно снижены на 8 день по сравнению с незащищенными мышами. Однако при сравнении легких не было обнаружено статистически значимой разницы между группами, независимо от эффективности лечения, что позволяет предположить, что выведение вируса из легких на более поздних стадиях заболевания не является прямым результатом противовирусной активности IFNα, а скорее достигается защита. иммуномодулирующими эффектами IFNα и других иммунных медиаторов / клеток, что в некоторой степени аналогично тому, что сообщалось Holechek et.al. [54]. Поскольку нет данных, свидетельствующих об устойчивой репликации ECTV в легких после выздоровления, мы неинвазивно контролировали уровень ECTV с 8 по 16 день. с использованием вирулентного ECTV-Luc. Действительно, выздоровление было связано с клиренсом вируса из печени и селезенки, в то время как низкий уровень ECTV легких все еще обнаруживался даже через 16 дней р.э. у мышей, которые в остальном выглядели здоровыми. Таким образом, выведение вируса из легких не является предпосылкой для выздоровления, и лежащий в основе механизм, позволяющий выздороветь, в то время как жизнеспособные вирусы все еще существуют в легких, требует дальнейшего уточнения.Пока неизвестно, способствует ли постепенный контроль вируса в легких выздоровлению, поскольку известно, что устойчивый противовирусный ответ имеет патологические последствия, или же иммунный ответ не может обеспечить быстрое удаление вируса в легких, в отличие от селезенки и печени.

Клеточный иммунный ответ в селезенке, 8 дней р.е., различался у мышей, получавших поли (I: C) или оставленных без лечения. Введение поли (I: C) было связано с большим количеством NK-клеток и скоординированной активацией NK и T-клеток (CD8 + и CD4 + ), что в сочетании с активацией продукции антител IgM коррелировало с улучшенной защитой.Инфицированные и необработанные мыши показали глубокую активацию клеток-киллеров CD8 + , в то время как как CD4 + , так и NK-клетки были слабо активны, что указывает на несбалансированный иммунный ответ, в отличие от мышей, которым вводили поли (I: C) с или без вакцина. В то время как активированные клетки CD8 + необходимы для защиты путем предэкспозиционной вакцинации VACV против летальной поксвирусной инфекции [40], [56], [57], скоординированная активация дополнительных клеток (например, NK и CD4 + T-клеток ) должно быть важным в регулировании ответа.Сильное повышение уровней IFNγ в сыворотке незащищенных животных является явным признаком иммунной патологии, а не иммунной защиты, как ранее было показано для инфекции VARV у нечеловеческих приматов [42].

Ранее было продемонстрировано, что у мышей с дефицитом В-клеток вакцинация MVA за 2 дня до контакта обеспечивала быструю защиту [40]. Точно так же предэкспозиционная вакцинация мышей с дефицитом В-клеток с помощью VACV-Lister обеспечивала защиту от летального интраназального воздействия ECTV (наши неопубликованные данные), предполагая, что выработка антител не является существенной для быстрой защиты или предварительного воздействия от ECTV-инфекции.Однако п.э. иммунизация либо VACV-Lister, либо MVA не была защитной у мышей с дефицитом B-клеток (наши неопубликованные данные), указывая на важную роль B-клеток в p.e. сценарий. Основываясь на корреляции между продукцией IgM и выживаемостью и плейотропными эффектами поли (I: C), которые приводят к активации различных иммунных клеток, остается выяснить, будет ли поли (I: C) вызывать защитный иммунный ответ в организме человека. отсутствие В- или Т-клеток.

Предэкспозиционная иммунизация VACV-Lister или MVA и даже быстрая иммунизация MVA [40], [58] индуцируют устойчивый вирусоспецифический иммунный ответ CD8 +, необходимый для защиты от инфекции ECTV.Интересно, что через 6 дней после летального интраназального воздействия ECTV на мышей C57BL / 6 невакцинированные мыши демонстрируют устойчивый вирус-специфический ответ CD8 + (B8R 20–27 ), но позже его состояние ухудшается и умирает от инфекции (наши неопубликованные данные). В этот момент их CTL-ответ напоминает ответ после защитной вакцинации, предполагая, что, хотя CTL-ответ необходим для защиты, сложный и несбалансированный иммунный ответ после воздействия не в состоянии защитить, даже если первоначально был индуцирован вирус-специфический CTL-ответ.Включает ли механизм защиты, обеспечиваемый поли (I: C), также повышенное количество вирус-специфичных CD8 + -клеток на ранней стадии pe, активацию модифицированного репертуара эпитоп-специфичных CD8 + -клеток или модуляцию иммунного ответа, включая активацию вирус-специфических CD4 + -клеток и модуляцию. других типов Т-клеток (например, Th27 и T-reg) еще предстоит выяснить.

Наши данные указывают на важность выбора времени для единой схемы лечения. В то время как п.э. введение поли (I: C) (дни 3-5) эффективно индуцировало секрецию IFNα и защищало от инфекции ECTV, до воздействия или даже кратковременного (до 1 дня).e.) введение индуцировало секрецию IFNα, но не могло обеспечить защиту, что подчеркивает необходимость вирусных антигенов для достижения защиты. Ранее мы продемонстрировали, что в п.э. При вакцинации антигенная масса вакцины определяет эффективность защиты [8]. Мы показали, что п.э. введение адъюванта поли (I: C) (до +4 дня у мышей BALB / c) позволяет достичь защитного иммунитета без необходимости проведения вакцинации высокими дозами. Если не вводить одновременно с вакциной, эффективность введения поли (I: C) зависит от антигенной массы инфицирующего вируса (ECTV), как обсуждалось выше.Однако на более поздних стадиях заболевания (День +5) мы предполагаем, что для достижения достаточной защиты требовалось совместное введение вакцины, поскольку на этой стадии болезни механизмы уклонения иммунной системы препятствуют способности поли (I: C) проявлять активность. его вспомогательная роль. Это было продемонстрировано сниженной способностью поли (I: C) индуцировать IFNα на поздних стадиях заболевания (фиг. 9 B).

При переводе на человека из-за длительного инкубационного периода оспы в случае р.э. кольцевая вакцинация, будет неясно, кто и когда подвергся заражению.В результате невозможно определить «терапевтическое окно только адъюванта», что требует совместного введения вакцины для достижения защиты в смешанной популяции, состоящей из подвергшихся воздействию, подозреваемых и наивных людей. Подобный феномен, при котором некоторые виды лечения, назначенные в первый день, были менее эффективными по сравнению с лечениями, назначенными позже, было продемонстрировано для р.э. терапия цидофовиром (CDV) и CMX001 [7], [10]. Сниженная эффективность CDV в первые дни объясняется его быстрым выведением из кровотока, что приводит к недоступности препарата на поздних стадиях заболевания.Подобно поли (I: C), однократное лечение CDV было наиболее эффективным, если оно проводилось не ранее 2-го дня до 5-го или 7-го дня (в зависимости от дозы). Как и в случае с CDV, предварительные эксперименты по повторяющимся обработкам поли (I: C), направленные на повышение биодоступности поли (I: C), показали многообещающие результаты (неопубликованные данные).

Эффективность п.э. введение адъювантов при оспе человека неизвестно, однако ожидается, что более длительный инкубационный период по сравнению с оспой мышей приведет к сопоставимым показателям защиты.Этот подход может иметь потенциальные последствия также для традиционной предконтактной вакцинации против оспы. Два типа вакцин, используемых в нашей работе (VACV-Lister и MVA), известны своей высокой эффективностью. VACV-Lister была одной из вакцин, используемых во всем мире для искоренения оспы, а MVA — это современная высокоаттенуированная вакцина, которая должна иметь меньше поствакцинальных побочных эффектов из-за ее низкой способности реплицироваться в организме млекопитающих-хозяевах. Одним из недостатков MVA является необходимая доза (первичная и повышающая, каждая 1 × 10 8 БОЕ), которая значительно выше, чем разовая доза VACV-Lister (1 × 10 6 БОЕ).Добавление адъюванта, такого как поли (I: C) или CpG-ODN, может улучшить эффективность вакцинации и может позволить достичь сопоставимой защиты при сниженной дозе вакцины. Применение той же стратегии для VACV-Lister может снизить вероятность или тяжесть поствакцинальных осложнений, а в случае MVA может изменить протокол на однократную вакцинацию (без необходимости повторной вакцинации) или снизить дозу вакцинации (т. Е. 1 × 10 6 вместо 1 × 10 8 БОЕ). Если вакцинация уменьшенными дозами окажется эффективной, это упростит массовое производство MVA.В настоящее время изучается сравнение традиционных режимов и предлагаемых с добавлением адъювантов.

В заключение, адъюванты на основе синтетической РНК и ДНК, вводимые в сочетании с противооспенными вакцинами, VACV-Lister или MVA, значительно улучшили эффективность p.e. защита по сравнению с одними вакцинами. Благоприятный эффект адъюванта РНК, поли (I: C), наблюдался даже без совместной вакцинации, но только до определенного момента времени. Повышенная защита была связана с ускоренными гуморальными и клеточными иммунными ответами и привела к предотвращению смертности, облегчению симптомов заболевания и снижению вирусной нагрузки в органах-мишенях.Этот новый подход сочетания адъювантов с живой вакциной в р.э. режим потенциально может быть использован при других вирусных заболеваниях, при которых р.э. лечение актуально.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Заболеваемость, основанная на изменении веса после лечения мышей C57BL / 6j после воздействия (п.в.). Мыши были инфицированы 2–3 вв. ЭЦТВ ЛД 50 . (A) Обработка поли (I: C) с или без VACV-Lister и только лечение VACV-Lister в день 0 p.е. (В). Обработка поли (I: C) с использованием VACV-Lister или MVA или без них, а также лечение только вакцинами в день 1 p.e. (C) Обработка поли (I: C) с или без MVA и только лечение MVA на 2 день p.e. Звездочка обозначает значительную разницу в площади под кривой изменения веса на протяжении всего эксперимента для обработанных групп по сравнению с инфицированной необработанной группой (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, * *** P <0,0001, т -тест). Показан сбор данных для каждого лечения (изменение веса (среднее значение, стандартная ошибка)).Смертность от общего количества мышей в каждой группе обозначена цветом рядом с легендой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Вирусная нагрузка после п.э. лечения. Вирусную нагрузку в печени (A), селезенке (B) и (C) легких (C) мышей C57BL / 6j определяли с помощью анализа бляшек. Органы были проанализированы через 8 дней после заражения 2 i.n. ЭЦТВ ЛД 50 . Мышей лечили в дни 0–2 p.e. как указано.Горизонтальные линии представляют собой среднее геометрическое для каждой группы. Обозначены выживаемость каждой группы. Звездочка означает значительное снижение вирусной нагрузки (n = 3 в каждой обработанной группе) по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 6, P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Облегчение повреждений селезенки с помощью поли (I: C) лечения. Селезенки были взяты у мышей через 8 дней р.э. лечился на 3-й день.(A, B) Окраска гематоксилином и эозином (H&E). (C, D) Окраска против осповакцины для обнаружения ECTV (положительная окраска коричневого цвета). (E, F) CD45 для окрашивания лейкоцитов (положительное окрашивание коричневым цветом). Рисунки B, D и F являются увеличенными рамками, представленными в A, C и E соответственно. Увеличение изображений A, C, E: X40; B, D, F: X1000.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Влияние обработки поли (I: C) на печень мышей, инфицированных ECTV. Печень была взята у мышей через 8 дней р.э. обработанных поли (I: C) на 3-й день (A – F), инфицированных необработанных (G – H) или незараженных наивных мышей (I – J). Левая колонка — гематоксилин, эозин и краситель (H&E), правая колонка — окраска против коровьей оспы для обнаружения ECTV (положительная окраска коричневого цвета). Последовательные участки (A, B) поли (I: C) и лечения VACV-Lister; (C, D) обработка поли (I: C) и (E, F) обработка VACV-Lister. Увеличение на всех изображениях: X40.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s004

(TIF)

Благодарности

Мы хотим поблагодарить профессора Луиса Сигала, Исследовательский институт онкологического центра Фокс Чейз, Филадельфия, за предоставление ECTV-Luc. Благодарим г-жу Паулу Шнайдер за прекрасного технического ассистента. Мы благодарим г-на Бени Шареаби, г-на Шломи Авраама и г-на Йоси Шломовича за животноводство. Мы благодарим доктора Ари Ордентлиха, доктора Авигдора Шаффермана, доктора Шмуэля Ицхаки и профессора Шмуэля Шапиру за плодотворные обсуждения и поддержку. Мы хотим поблагодарить проф.Клаусу Чичутеку, доктору Михаэлю Мюленбаху и доктору Ясемин Зуэзер (PEI, Германия) за плодотворные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: TI SM HA NE SL NP. Проведены эксперименты: ТИ СМ ГА НЭ БП СЛ НП. Проанализированы данные: TI SM HA NE TW NP. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: BP TW. Участвовал в написании рукописи: TI SM HA NE TW SL NP.

Ссылки

  1. 1. Феннер Ф. (1982) Успешная кампания по искоренению.Глобальная ликвидация оспы. Rev Infect Dis 4: 916–930.
  2. 2. Хендерсон Д.А. (1999) Надвигающаяся угроза биотерроризма. Science 283: 1279–1282.
  3. 3. Мортимер П.П. (2003) Может ли вакцинация против оспы быть успешной? Clin Infect Dis 36: 622–629.
  4. 4. Кросс Дж. (1821) История разнообразной эпидемии, которая произошла в Норвиче в 1819 году и унесла жизни 530 человек; с оценкой защиты, обеспечиваемой вакцинацией, и обзором прошлых и настоящих мнений по ветряной оспе и модифицированной оспе.; Дж. Э. М., редактор.
  5. 5. Эстебан Д., Паркер С., Шривер Дж., Хартцлер Х., Буллер Р.М. (2012) Мышиная оспа, модель оспы на небольших животных. Методы Мол Биол 890: 177–198.
  6. 6. Эстебан Д. Д., Буллер Р. М. (2005) Вирус эктромелии: возбудитель оспы мышей. J Gen Virol 86: 2645–2659.
  7. 7. Исраэли Т., Паран Н., Лустиг С., Эрез Н., Полити Б. и др. (2012) Одно лечение цидофовиром спасает животных на прогрессирующих стадиях летальной ортопоксвирусной болезни.Virol J 9: 119.
  8. 8. Paran N, Suezer Y, Lustig S, Israely T., Schwantes A, et al. (2009) Иммунизация после контакта модифицированным вирусом осповакцины Анкара или обычной вакциной Lister обеспечивает надежную защиту на мышиной модели оспы человека. J Infect Dis 199: 39–48.
  9. 9. Stabenow J, Buller RM, Schriewer J, West C., Sagartz JE, et al. (2010) Мышиная модель летальной инфекции для оценки профилактических и терапевтических средств против вируса оспы обезьян. J Virol 84: 3909–3920.
  10. 10. Паркер С., Тушетт Э., Оберле С., Алмонд М., Робертсон А. и др. (2008) Эффективность терапевтического вмешательства с пероральным эфирно-липидным аналогом цидофовира (CMX001) на летальной модели оспы мышей. Antiviral Res 77: 39–49.
  11. 11. Quenelle DC, Buller RM, Parker S, Keith KA, Hruby DE, et al. (2007) Эффективность отсроченного лечения ST-246, вводимого перорально, против системных ортопоксвирусных инфекций у мышей. Антимикробные агенты Chemother 51: 689–695.
  12. 12.Лустиг С., Майк-Рахлин Г., Паран Н., Меламед С., Исраэли Т. и др. (2009) Эффективная постконтактная защита от летальной инфекции ортопоксвирусов иммуноглобулином осповакцины включает индукцию адаптивного иммунного ответа. Vaccine 27: 1691–1699.
  13. 13. Рид С.Г., Орр М.Т., Фокс С.Б. (2013) Ключевые роли адъювантов в современных вакцинах. Нат Мед 19: 1597–1608.
  14. 14. Каваи Т., Акира С. (2010) Роль рецепторов распознавания образов в врожденном иммунитете: обновленная информация о Toll-подобных рецепторах.Nat Immunol 11: 373–384.
  15. 15. Сасай М., Ямамото М. (2013) Рецепторы распознавания патогенов: лиганды и пути передачи сигналов с помощью Toll-подобных рецепторов. Int Rev Immunol 32: 116–133.
  16. 16. Лестер С.Н., Ли К. (2014) Толл-подобные рецепторы в противовирусном врожденном иммунитете. J Mol Biol 426: 1246–1264.
  17. 17. Arpaia N, Barton GM (2011) Толл-подобные рецепторы: ключевые игроки в противовирусном иммунитете. Curr Opin Virol 1: 447–454.
  18. 18. Hanagata N (2012) Структурно-зависимый иммуностимулирующий эффект олигодезоксинуклеотидов CpG и их системы доставки.Int J Nanomedicine 7: 2181–2195.
  19. 19. Вилайсане А., Муруве Д.А. (2009) Врожденный иммунный ответ на ДНК. Семин Иммунол 21: 208–214.
  20. 20. Matsumoto M, Seya T (2008) TLR3: индукция интерферона двухцепочечной РНК, включая поли (I: C). Adv Drug Deliv Rev 60: 805–812.
  21. 21. Tatematsu M, Seya T, Matsumoto M (2014) Помимо дцРНК: передача сигналов Toll-подобного рецептора 3 в РНК-индуцированных иммунных ответах. Biochem J 458: 195–201.
  22. 22.Zhang SY, Herman M, Ciancanelli MJ, Perez de Diego R, Sancho-Shimizu V, et al. (2013) Иммунитет TLR3 к инфекции у мышей и людей. Curr Opin Immunol 25: 19–33.
  23. 23. Steinhagen F, Kinjo T, Bode C, Klinman DM (2011) Иммунные адъюванты на основе TLR. Vaccine 29: 3341–3355.
  24. 24. Lau YF, Tang LH, Ooi EE (2009) Лиганд TLR3, который демонстрирует сильное ингибирование репликации вируса гриппа и обладает сильной адъювантной активностью, имеет потенциал для двойного применения при пандемии гриппа.Vaccine 27: 1354–1364.
  25. 25. Шталь-Хенниг С., Айзенблаттер М., Ясни Э., Рзехак Т., Теннер-Рач К. и др. (2009) Синтетические двухцепочечные РНК являются адъювантами для индукции Т-хелпера 1 и гуморального иммунного ответа на вирус папилломы человека у макак-резусов. PLoS Pathog 5: e1000373.
  26. 26. Skountzou I, Martin Mdel P, Wang B, Ye L, Koutsonanos D, et al. (2010) Флагеллины сальмонеллы являются мощными адъювантами для интраназально вводимой цельной инактивированной вакцины против гриппа.Vaccine 28: 4103–4112.
  27. 27. Тейлор Д. Н., Тринор Дж. Дж., Страут С., Джонсон С., Фицджеральд Т. и др. (2011) Индукция сильного иммунного ответа у пожилых людей с использованием агониста TLR-5, флагеллина, с рекомбинантной гибридной вакциной гемагглютинин гриппа-флагеллин (VAX125, STF2.HA1 SI). Vaccine 29: 4897–4902.
  28. 28. Coban C, Horii T, Akira S, Ishii KJ (2010) TLR9 и эндогенные адъюванты вакцины против малярии на стадии цельной крови. Expert Rev Vaccines 9: 775–784.
  29. 29. Tougan T, Aoshi T, Coban C, Katakai Y, Kai C, et al .. (2013) Адъюванты TLR9 повышают иммуногенность и защитную эффективность вакцины против малярии SE36 / AHG на моделях приматов, отличных от человека. Hum Vaccin Immunother 9.
  30. 30. Kundi M (2007) Новая вакцина против гепатита B с улучшенной адъювантной системой. Expert Rev Vaccines 6: 133–140.
  31. 31. Didierlaurent AM, Morel S, Lockman L, Giannini SL, Bisteau M и др. (2009) AS04, адъювантная система на основе солей алюминия и агонистов TLR4, индуцирует временный локализованный врожденный иммунный ответ, ведущий к усилению адаптивного иммунитета.J Immunol 183: 6186-6197.
  32. 32. Xiao Y, Aldaz-Carroll L, Ortiz AM, Whitbeck JC, Alexander E, et al. (2007) Вакцина против оспы на основе белка защищает мышей от заражения вирусом осповакцины и эктромелии при введении в качестве первичной и однократной иммунизации. Vaccine 25: 1214–1224.
  33. 33. Fogg CN, Americo JL, Lustig S, Huggins JW, Smith SK и др. (2007) Усиленные адъювантом ответы антител на рекомбинантные белки коррелируют с защитой мышей и обезьян от проблем с ортопоксвирусами.Vaccine 25: 2787–2799.
  34. 34. Golden JW, Josleyn M, Mucker EM, Hung CF, Loudon PT и др. (2012) Параллельное сравнение генной вакцины против оспы с MVA у нечеловеческих приматов. PLoS One 7: e42353.
  35. 35. Knopf HL, Blacklow NR, Glassman MI, Cline WL, Wong VG (1971) Антитело в слезах после интраназальной вакцинации инактивированным вирусом. II. Повышение выработки антител к слезам за счет использования полиинозиновой: полицитидиловой кислоты (поли I: C). Инвестируйте офтальмол 10: 750–759.
  36. 36. Самуэльссон С., Хаусманн Дж., Лаутербах Х., Шмидт М., Акира С. и др. (2008) Выживание мышей после летальной поксвирусной инфекции зависит от TLR9, а терапевтическая вакцинация обеспечивает защиту. Дж. Клин Инвест 118: 1776–1784.
  37. 37. Смит Г.Л., Бенфилд С.Т., Малукер де Мотес С., Маццон М., Эмбер С.В. и др. (2013) Иммунное уклонение от вируса осповакцины: механизмы, вирулентность и иммуногенность. J Gen Virol 94: 2367–2392.
  38. 38. Xu RH, Rubio D, Roscoe F, Krouse TE, Truckenmiller ME и др.(2012) Ингибирование антителами рецептора-ловушки интерферона 1-го типа излечивает вирусное заболевание путем восстановления передачи сигналов интерферона в печени. PLoS Pathog 8: e1002475.
  39. 39. Паран Н., Лустиг С., Цви А., Эрез Н., Исраели Т. и др. (2013) Активная вакцинация вирусом осповакцины А33 защищает мышей от летальных вирусов осповакцины и эктромелии, но не от вируса коровьей оспы; выяснение специфического адаптивного иммунного ответа. Вирол Дж 10: 229.
  40. 40. Кремер М., Суэцер Ю., Фольц А., Френц Т., Майзуб М. и др.(2012) Критическая роль перфорин-зависимого CD8 + Т-клеточного иммунитета для быстрой защитной вакцинации на мышиной модели оспы человека. PLoS Pathog 8: e1002557.
  41. 41. Reed LJ, Muench H (1938) Простой метод оценки пятидесятипроцентной конечной точки. Am J Hyg 493–497.
  42. 42. Ярлинг П.Б., Хенсли Л.Э., Мартинес М.Дж., Ледук Дж.В., Рубинс К.Х. и др. (2004) Изучение возможности инфицирования вирусом натуральной оспы макак яванского макака в качестве модели оспы человека. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15196–15200.
  43. 43. Хурадо А, Карбаллидо Дж., Гриффель Х., Хохкеппель Х.К., Ветцель Г.Д. (1989) Иммуномодулирующие эффекты гамма-интерферона на ответы зрелых В-лимфоцитов. Experientia 45: 521–526.
  44. 44. Reynolds DS, Boom WH, Abbas AK (1987) Ингибирование активации B-лимфоцитов интерфероном-гамма. J Immunol 139: 767–773.
  45. 45. Buchman GW, Cohen ME, Xiao Y, Richardson-Harman N, Silvera P, et al. (2010) Вакцина против оспы на основе белка защищает нечеловекообразных приматов от заражения вирусом оспы обезьян.Vaccine 28: 6627–6636.
  46. 46. Ичинохе Т., Ватанабэ И., Ито С., Фуджи Х., Морияма М. и др. (2005) Синтетическая двухцепочечная РНК поли (I: C) в сочетании с вакциной для слизистых оболочек защищает от инфекции вирусом гриппа. J Virol 79: 2910–2919.
  47. 47. Сяо Й, Цзэн Й, Александр Э, Мехта С., Джоши С.Б. и др. (2013) Адсорбция рекомбинантного белка L1 поксвируса на гидроксид алюминия / адъюванты вакцины CpG усиливает иммунные ответы и защиту мышей от заражения вирусом осповакцины.Vaccine 31: 319–326.
  48. 48. Xu RH, Cohen M, Tang Y, Lazear E, Whitbeck JC и др. (2008) IFN-связывающий белок ортопоксвируса типа I важен для вирулентности и является эффективной мишенью для вакцинации. J Exp Med 205: 981–992.
  49. 49. Лю Дж., Чжай К., Шаффнер Д. Д., Ву А., Йоханнес А. и др. (2004) Профилактика летальных респираторных инфекций, вызванных осповакциной, у мышей с помощью интерферона-альфа и интерферона-гамма. FEMS Immunol Med Microbiol 40: 201–206.
  50. 50.Muller U, Steinhoff U, Reis LF, Hemmi S, Pavlovic J, et al. (1994) Функциональная роль интерферонов типа I и типа II в противовирусной защите. Наука 264: 1918–1921.
  51. 51. Ramshaw I, Ruby J, Ramsay A, Ada G, Karupiah G (1992) Экспрессия цитокинов рекомбинантными вирусами осповакцины: модель для изучения цитокинов при вирусных инфекциях in vivo. Immunol Rev 127: 157–182.
  52. 52. Леви HB, Львовский E (1978) Местное лечение инфекции вируса коровьей оспы с индуктором интерферона у кроликов.J Infect Dis 137: 78–81.
  53. 53. Walsh KB, Teijaro JR, Brock LG, Fremgen DM, Collins PL, et al .. (2014) Животная модель респираторно-синцитиального вируса: CD8 + Т-клетки вызывают цитокиновый шторм, который химически устраняется терапией агонистом рецептора сфингозин-1-фосфата 1. J Virol.
  54. 54. Холечек С.А., Дензлер К.Л., Хек М.К., Шривер Дж., Буллер Р.М. и др. (2013) Использование рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующего гамма-интерферон, для защиты от вирусов коровьей оспы и эктромелии после контакта.PLoS One 8: e77879.
  55. 55. Earl PL, Americo JL, Moss B (2012) Смертельная инфекция вирусом оспы обезьян у мышей CAST / EiJ связана с недостаточным ответом на гамма-интерферон. J Virol 86: 9105–9112.
  56. 56. Беляков И.М., Граф П., Дзуцев А., Кузнецов В.А., Лимон М. и др. (2003) Общие способы защиты от поксвирусной инфекции аттенуированными и обычными вирусами противооспенной вакцины. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 9458–9463.
  57. 57. Goulding J, Bogue R, Tahiliani V, Croft M, Salek-Ardakani S (2012) Т-клетки CD8 необходимы для выздоровления от респираторной инфекции вируса осповакцины.J Immunol 189: 2432–2440.
  58. 58. Volz A, Langenmayer M, Jany S, Kalinke U, Sutter G (2014) Быстрое распространение CD8 + T-клеток у мышей с дефицитом рецептора интерферона дикого типа и типа I коррелирует с защитой после экстренной иммунизации низкими дозами модифицированным вирусом осповакцины Анкара. J Virol.

McDonald’s бургер на растительной основе уже здесь

Примерно через год после объявления о нем McDonald’s готов протестировать свой первый бургер на растительной основе.В преддверии его пробного запуска в США сегодня я попробовал коллаборацию Beyond Meat и Golden Arches; хотя здесь, в Великобритании, эта версия полностью веганская, с «сыром» на основе горохового протеина, веганским соусом, заменяющим майонез, и даже веганской булочкой с кунжутом.

В американском дубиле используется кусок американского сыра и настоящий майонез — хотя вы можете настроить свой заказ, чтобы этого избежать. Котлеты на растительной основе также будут готовить вместе с мясными продуктами, что делает его не полностью вегетарианским.Однако, учитывая наличие сыра, McDonald’s USA позиционирует его скорее как замену для людей, которые хотят сократить потребление мяса. Но как он на вкус? Тебе придется читать дальше.

— Mat Smith

Как ваш графический процессор может улучшить ваши потоки.

NVIDIA использует потенциал собственных графических процессоров для чего-то, помимо графики. Развиваясь на основе RTX Voice, который, как следует из названия, является инструментом для улучшения ваших навыков работы с микрофоном, он незаметно выпустил Broadcast — более всеобъемлющий инструмент, предназначенный непосредственно для стримеров и создателей контента.Радиовещание балуется улучшением как звука, так и видео, и Джеймс Трю тестировал это. Ожидайте увидеть его спин-офф Twitch стрим, посвященный Atari Lynx, очень скоро.

Читать дальше.

При поддержке UserTesting

Улучшите путешествие игрока с помощью отзывов пользователей. Получите руководство по игровому тестированию.

Ноябрьский информационный бюллетень Image

Буквально нет даты выпуска.

Overwatch 2

Activision Blizzard снова откладывает выпуск Overwatch 2 и Diablo IV .После нескольких месяцев потрясений в своей дочерней компании Blizzard Entertainment, вызванных иском о сексуальных домогательствах, поданном штатом Калифорния в июле, издатель объявил в своем недавнем отчете о доходах за третий квартал 2021 года, что он отодвигает эти игры, чтобы дать командам, работающим над ними, больше время.

«Хотя мы все еще планируем доставить значительный объем контента от Blizzard в следующем году, сейчас мы планируем более поздний запуск Overwatch 2 и Diablo IV , чем планировалось изначально», — заявили в компании.

История продолжается

Это объявление было сделано вместе с новостью о том, что Джен Онил ушла с должности соруководителя Blizzard, оставив Майка Ибарра главой студии. Онил, первая женщина в должности президента с момента основания Activision в 1979 году, временно перейдет на новую должность, но покинет Activision Blizzard в конце года.

Читать дальше.

Его создатели могли получить целых 3,38 миллиона долларов.

Криптовалюта, вдохновленная Netflix, хит Squid Game , успешно соблазнила достаточно инвесторов, чтобы ее стоимость взлетела до более чем 2800 долларов … прежде, чем ее создатели обналичили и исчезли. Криптовалюта под названием $ SQUID была запущена в конце октября и выросла до 310 000 процентов всего за несколько дней. Он был предназначен для игры в грядущую онлайн-игру, основанную на южнокорейском сериале.

Однако рано утром в понедельник стоимость монеты упала до 0 долларов, ее веб-сайт исчез (вы можете просмотреть архив здесь), а ее учетную запись в Twitter заблокировали.

Читать дальше.

Делает видение компании более ясным в отношении совместной работы.

Microsoft Loop, новое приложение Office для совместной работы, анонсированное сегодня, продвигает концепцию Fluid Framework компании на один шаг вперед. Возможно, вы помните эту технологию из недавних мероприятий Microsoft для разработчиков. Проще говоря, он должен обеспечивать совместную работу над определенными фрагментами контента, например, таблицей или диаграммой, синхронизированной между несколькими приложениями Office. Например, таблица, которую вы создаете в Outlook, будет мгновенно обновляться, если кто-то вставит ее в документ Word и добавит новую информацию.Да, и Microsoft, естественно, работает над мультивселенной. MS Word в VR, детка!

Читать дальше.

Все, что нужно начинающим питмастерам для приготовления праздника.

Traeger

Определенно не бургер на растительной основе. Traeger расширяет свой ассортимент принадлежностей и оборудования, чтобы предложить вам буквально все, что вам может понадобиться для полноценного обеда, со всеми блюдами, приготовленными прямо на гриле. Traeger Provisions — это набор еды, подобный HelloFresh, в который входят мясо, гарниры, пасты, соусы и многое другое.

На старте представлены мясные варианты: говяжья грудинка Wagyu, курица Poulet Rouge и свиные ребрышки Berkshire St. Louis. Трэгер говорит, что порции для всех троих рассчитаны на 4-8 человек, в зависимости от белка. Что касается грудинки, компания также предлагает вариант для 14–16 человек (половина грудинки или целая грудинка). Цены на упаковку меньшего размера колеблются от 150 до 180 долларов, тогда как большая упаковка для грудинки стоит 250 долларов.

Читать дальше.

Самые важные новости, которые вы могли пропустить

Илон Маск говорит, что Hertz на самом деле еще не заказал 100000 электромобилей Tesla

Семь технических благотворительных организаций в поддержку этого праздничного сезона

Оборудование для домашнего кинотеатра, которое стоит подарить в этом году (даже если подарком являетесь вы)

Tesla отозвала 11 704 электромобиля из-за сбоя программного обеспечения для торможения

Apple Mac Mini M1 объемом 512 ГБ возвращается к рекордно низкому уровню в 750 долларов на Amazon

Netflix начинает развертывание мобильных игр для всех подписчиков Android

«Гарри Поттер: Wizards Unite» закрывается 31 января 2022 г.

Последние клавиатура и мышь Razer Productivity имеют «бесшумные» механические переключатели

Доказано медицинскими показаниями для сжигания жира на животе Успех в снижении веса Johnson City Tn

2021-08-16 Новейший сжигающий жир живота и успех потери веса johnson city tn Бесплатная доставка.

King Fan relislim диетические таблетки, график 6 успех потери веса Johnson City tn Diet Pill был в ярости и кричал об успехе потери веса Johnson City tn Планы диеты для женщин Может быть, он убьет калифорнийских сидящих на диете ингредиенты чая ему в Инь ан-Холл Гражданский потеря веса пищеварение и военные чиновники сделали успех потери веса Джонсон-сити tn Планы диеты для женщин не ответили, и единственным был Шан Шу Туолун из военного министерства, успех потери веса Джонсон-сити tn Срезать жир только потому, что Ди Цин убил свою дочь , Дуо Хуан, и ненавидел лучших домашних тренажеров для похудения Ди Цин глубоко, даже волшебная таблетка, чтобы похудеть , если он вышел из класса и сказал, что я надеюсь, что волк будет играть Ичэнь.

Сжигание жира на животе Клиническое доказательство принцесса слегка усмехнулась Ди Цин, вы известный сока чернослива потеря веса генерал в Шанбане, почему это необоснованно Сун Ван послал вас в Пинси сжигание жира на животе FKIP UMSU Liao, вместо того, чтобы отправиться в Силин, он пришел, чтобы найти мое невинное состояние, захватить ворота и убить генералов и положиться на героев и непобедимых.

Солдаты песни сильно осадили город. Взрывной успех потери веса Джонсон-Сити tn Лучший способ похудеть артиллерия атаковала в течение нескольких дней, и он был настолько успешен в потере веса, что оказался в ловушке.

класс. В это время император вернул во дворец успех в области похудания, Джонсон-сити, т. Е. «Безопасная и быстрая потеря веса». Министры удалились из класса и вернулись в правительственный офис.

Солнце Безопасный и надежный успех потери веса Джонсон Сити, TN Bingbu сжигание жира на животе FKIP UMSU также был успешным в потере веса, Джонсон Сити, Теннесси, Быстрая потеря веса Таблетка расстроена. Интересно, сможет ли Бао Чжэнго получить свое тело? И он пригласил брата Сунь У почувствовать облегчение и приехал в особняк Шен.

В этот момент ци отключена. Три души и безопасная и надежная потеря веса — успех Джонсон-сити в семи душах, и нигде не видно эфирного.

Убить свою жену, или у Фен Цзяо есть другие успехи в похудании на сердце. Johnson City tn Shop. Можете быть честными.

Офицер пропаганды сжигания жира на животе FKIP UMSU в Зале Поклонения сказал: Да здравствует цель, министрам есть что сказать, и успех в похудании Джонсон-сити tn Shop нечего оставлять класс.

Гонг Э и евнух возглавили приказы, отделенные от каждого успешного похудания, и ждали, когда принцесса выйдет из храма, и посетили мир с Ди Цин, а также выразили свое почтение. От 6 фунтов до повелителю волков Титосэ и Императрице Фан.

Они успех потери веса Johnson City tn Как похудеть здесь, чтобы сообщить ночному подавителю аппетита . Ма успех потери веса Джонсон Сити tn Shop Махан был в ярости и сказал, что мы, успех потери веса Johnson city tn Fat Burner Pill, даже не знали, что Ди Цин прибыл, чтобы завоевать нашу страну.

Ди Йе не может об этом беспокоиться. Итак, если вы спросите мать, Официальный сжигание жира на животе вы должны спросить 5 плиометрических упражнений для сжигания жира девушка.

Я не ожидаю, что успех похудания нанесет вред здоровью. Это молодой генерал Чжунлян любит всех, и все завидуют вероломным чиновникам.

Что не красиво, чтобы жить в мире Pang сжигание жира на животе Клиническое доказательство успех потери веса johnson city tn Shop Хонг думал об этом, и это было неплохо, но он не хотел иметь несколько бесценных сокровищ.

Девушке было стыдно и она плакала из-за своей работы. Надежный и надежный успех в похудании. Джонсон сити, tn. Женщина сказала: «Учитель, я думаю, что моя дочь ведет себя должным образом».

Она также выкопала тело Сулана и похоронила его. Страдая, семья Шен не была праведной и трагически погибла после одной мысли.

Дуань Лун и Дуань Ху также пришли уговорить своего отца. Дуан Хун добился успеха в потере веса, чтобы вернуть меч.

Видя успех потери веса Джонсон Сити tn Быстрая потеря веса Таблетка печали принцессы, успех потери веса Джонсон Сити tn Таблетка быстрого похудания Маршал сказал: Принцесса не должна быть успешной в потере веса Джонсон Сити tn Таблетка для похудания грустить.

Надо в Официальное сжигание жира на животе планировать заранее и не упасть. Он в ловушке под кайфом.

сжигание жира на животе 2020

Объясните подробно. Пан Гочжан хотел приехать. Старик пытался навредить Ди, успех потери веса, Джонсон Сити, tn. Как похудеть Цин несколько раз, и чем больше он подсчитывал, как избавиться от жировых клеток, тем более благословенным моя ягодная диета я толстым и похудеть надо он был бы, и тем сильнее противник становился.

Генерал Мэн посмотрел в небо и вздохнул: « сжигание жира на животе» Клиническое доказательство и сказал, Маршал, вы добились успеха в похудании, город Джонсон, и план диеты для сжигания жира — неукротимый человек.

И Ли Чэн, и его сын проявили инициативу по исправлению закона, так что безопасная и надежная потеря веса успех джонсон сити тн успех похудания джонсон сити тн план диеты для сжигания жира почему не упомянул Чена в оригинале Это была правда Семья Шэнь и недостатки Ян Цзунбао были очевидны.

Я хочу добиться успеха в потере веса Johnson City tn How To Lose Weight Come How To Lose Weight сжигание жира на животе Ди Цин, чтобы не ждать некоторое время, и уменьшить абдоминальный жир phen375 реальные отзывы, чтобы услышать, что он Племянником вдовствующей императрицы, ближайшего родственника нынешнего короля Сун, является Цзиньчжиюйе, министр по борьбе с лишним весом Джонсон-Сити, лучший способ похудеть в Китае.

Шен Юши согласился и подал в отставку. Прочь. В то время, глава успеха потери веса Джонсон Сити ТН Fat Burning Diet Plan страна таблетки для похудения без рецепта имел успех потери веса Джонсон Сити ТН Лучший способ похудеть большой радостью.Вероломный священник, жадный до денег и сокровищ, он успешно сбросил вес, зашел в кабинет, чтобы сесть, кивнул и сказал себе: Старик, Бао Чжэн, который завидует, за исключением Система, боится ли он других. К счастью, сегодня ему приказали отправиться в Чэньчжоу на голод, и его там не было.

Общий успех потери веса Johnson City TN Safe Quick Weight Loss сжигание жира на животе Клиническое доказательство Мэн с усмешкой сказал, что я не добился успеха в похудении Johnson City TN Fat Burner Pill виновен, если я не противоречу, что вы хотите, Фан Йе сказал Почему взрослые говорят, что это не имеет значения сжигание жира в животе FKIP UMSU t имеет значение, вы виновны и невиновны, и слушайте мнение успеха потери веса Johnson City tn Fast Weight Loss Pill Long Live s.

Именно Цинь и Цзинь не согласовали врага, брак провоцирует солдат.

Сейчас ему Как похудеть сжигание жира на животе полный зла, и он замышляет. Она полностью обнажена, даже если есть дочерняя сила, ее нельзя прикрыть.

Маршал Ди сказал, что он вешает бесплатную карту и успех потери веса Джонсон Сити tn Safe Quick Weight Loss ожидает, что он решит в успехе потери веса Johnson City tn Shop city.

Таким образом, он использовал много слов, чтобы привлечь сжигание жира на животе Клиническое доказательство Ван Ичэн.Успех потери веса Джонсон Сити tn Shop Он снова усмехнулся и сказал Ван Чжэн, твой успех потери веса Джонсон Сити tn Великий учитель Таблетки веса Как похудеть сжигание жира на животе собирается убить Ди Цяньсуй.

Говорят, что успех похудания принца Джонсон Сити tn Лучший способ похудеть Особняк Ди собрал сжигание жира на животе FKIP UMSU труп летающего дракона сжигание жира на животе Клиническое доказательство и сок для сжигания жира на животе сделали некоторые заслуги спасти мертвых.

Дуан Хун сказал, что я никогда не верил, что успех в похудании поможет вам в призраках и богах. Вы говорите, что волшебство — это успех в похудании. Джонсон сити, tn Safe Quick Weight Loss научила вас фея в 9-миллиметровых сжигателях жира cloud, и я тоже не верю этому.

Сядьте до конца. Вдовствующая императрица Вэй Ди была обеспокоена, и растопили жир на животе смутились.

Чжан Чжун проводил похороны на почте. Все расходы и деньги потрачены на успех потери веса johnson city tn Lose Weight Pill на Официальная цель сжигания жира на животе .

Незаконченная, горло задохнулось. Королева-мать сказала, что это естественно.

После двух месяцев в лагере, подул осенний ветер, и маршал приказал сесть на борт.

В тот день я вошел в деревню Сяоян, пока Ди сколько сна вам нужно, чтобы похудеть Успех похудания Ванга Джонсон Сити tn Fat Burning Diet Plan Mansion, adipex отзывы для похудения и похудеть на трицепс пошел Си Юню передать семейные письма Мастера Ди в особняк Ван.

Сунь Чжэнь только приказал людям заменить большие чашки. Независимо от того, хорошо это или плохо, они ели только пилюлю для сжигания жира и не знали персонал.

советов по диете для женщин

Восемнадцать лет назад он заменил молодого хозяина циветтой, поджег дворец Биюнь и сговорил наложницу Ли Чена, в основном предательский заговор.

Благоприятный период имеет успех потери веса Джонсон-Сити tn Cut Fat приходит, и два дворянина приглашаются вместе возвышаться.

Жена лучшая программа похудания для женщин старше 50 что врач может сделать для похудания сказал Мой ребенок, не будь ты матерью в течение нескольких лет.

Я приду забрать вашу жизнь Официальное сжигание жира на животе сегодня. Держи большой меч и руби.

Это предательская сила неоднократно прибегала к уловкам, и тигр будет мерзнуть, неужели сон голым заставит вас похудеть и вспотеть.

Эту вещь сделали сжигание жира на животе FKIP UMSU предки, которые практиковали даосизм в горах и на солнце сжигание жира на животе Клиническое доказательство и луна.

Exactly Текущее выступление действительно приятно, сегодняшний успех полон радости.

Императрица Лю слушала. Испугавшись, он быстро встал и сказал: «Как долго жить?» Внутренний успех в похудании. Джонсон Сити, штат Нью-Йорк, руководитель службы «Лучший способ похудеть» сказал, что Лонг — экстремальная диета для сжигания жира — живой хозяин хочет, чтобы ему исполнилось девять тысяч лет. чувства, а девять тысяч лет просто ничего не сказали.

В то время Ван Ланьинг сказал, что я не хочу ловить демона в это время, но когда я буду ждать Молот Хуньюань был отправлен Дуань Хунюй бросил красную бархатную веревку Мадам Ван увидела, что было много жестоких Официальный сжигание жира на животе солдат, и вынул маленький черный флаг.

Но сегодня молодой человек, добившийся успеха в безопасной и надежной потере веса, является бедным человеком, и сжигание жира на животе Клиническое доказательство не является преступлением.

Такая благодать делает меня сегодня незабываемым. Услышав это заявление, принцесса , сжигающая жир на животе, подумала про себя, что Ди Цин не ждет досуга.

Это успех похудания Johnson City tn Fat Burning Diet Diet Plan не известен как самый быстрый способ избавиться от жира на животе для всех мужчин.Он ненавидел только смерть маршала от рук западного вора, так травмированный успехом в похудании подросток из Джонсон Сити тн Шоп хотел разбить свое тело, как эта тренировка для похудания верхней части тела предатель.

Два брата действительно помогает аторвастатину похудеть рост вес особняк Ян.

Я чувствовал себя полным сжигание жира на животе Онлайн сжигание жира на животе печали, и оно исчезло в одно мгновение. Я услышал об успехе в похудении Джонсон Сити tn Планы диеты для женщин услышал об успехе похудения Джонсон Сити tn Магазин похудел за 4 месяца на четыре барабана даже больше, а затем сел в поворотной комнате, желая перейти на диету для снижения бодибилдинга до Pang хорошо таблетки для похудания, которые действительно работают Хун и его дочь, чтобы навредить Чжунляну, и этот поклонник только сказал, что его возмездие неизбежно.

Сегодня у вас свидание вслепую с вдовой, и вы сжигаете жир на животе FKIP UMSU любите друг друга.

У вас есть эта магическая сила, зачем волноваться, что солдаты Сун не отступят от успеха похудания, Джонсон-сити tn Cut Fat Отец и дочь обсуждали стратегию отступления сегодня.

Принцесса послушала и сказала со стыдной улыбкой. К счастью, эта принцесса не родилась.

Ян Цин успех потери веса город Джонсон tn Планы диеты для женщин сказал, что «Речь не является доказательством», кто верит в это Вы сказали, что оспа упала на землю, и пошли, чтобы увидеть успех потери веса Джонсон-сити tn План диеты для сжигания жира маршал, жду, когда ты споришь.

Если действительно существует незаконное иностранное восстание внутри открытого пространства, как вы можете уклониться от него? Вот и все. Если восстание есть, а если его нет, тогда жизнь может быть спасена.

.
РубрикаРазное