Осп плиты применение: Применение ОСП плиты в строительстве и ремонте

БЛОК МЕЛИССЫ, ХОЗЯИН:

Представители федерального здравоохранения объявили сегодня, что они сделали тревожное открытие. Ученые нашли флаконы со смертельным вирусом оспы в старом помещении для хранения в незащищенной правительственной лаборатории за пределами Вашингтона, округ Колумбия.В 1980 году вирус оспы был объявлен полностью искорененным в мире.Предполагается, что он будет храниться только в двух местах в мире — в лаборатории строгого режима в Атланте и еще одной такой лаборатории в России. Джефф Брамфил из NPR присоединяется к нам, чтобы рассказать нам больше. И Джефф, что случилось? Как они нашли эти флаконы с вирусом оспы?

ДЖОФФ БРУМФИЛ, УСТАВ: 1 июля ученые в кампусе Национального института здоровья убирали старую лабораторию, принадлежавшую Управлению по контролю за продуктами и лекарствами. Они нашли флаконы с этикеткой вируса натуральной оспы. Это официальное название оспы, которая, возможно, является самой смертельной болезнью, когда-либо поражавшей человечество.Он покрывает тело ужасными нарывами и убивает около 30 процентов своих жертв. Последний известный случай произошел в 1977 году. Мы думали, что всего в двух лабораториях в мире все еще есть образцы, так что это стало большим шоком.

БЛОК: Итак, они нашли эти флаконы. А что с ними тогда случилось?

БРУМФИЛ: К счастью, рабочие сразу узнали, что у них есть. Они положили флаконы обратно в коробки и переместили их в лабораторию Национального института здравоохранения с третьим уровнем биобезопасности. Затем они уведомили сотрудников Центров по контролю за заболеваниями.Они вызвали ФБР и привлекли местные правоохранительные органы для охраны образцов. Вчера вечером их перевели в штаб-квартиру CDC в Атланте и поместили в лабораторию четвертого уровня биобезопасности с еще более высоким уровнем безопасности. Это такая лаборатория, где люди носят лунные костюмы. Вы видите их в фильмах. Предварительные тесты ДНК показали, что в шести флаконах содержался вирус оспы, хотя CDC пока не может подтвердить, был ли он по-прежнему заразным.

: И смогли ли они отследить, откуда вообще взялись эти флаконы с вирусом оспы?

БРУМФИЛ: Файлы датируются 1950-ми годами.И я поговорил с CDC, и они не хотели строить никаких предположений, кроме этого. Я также поговорил с Д. А. Хендерсоном, исследователем, который руководил усилиями по искоренению оспы. И он говорит, что это, вероятно, просто сэмплы, которые кто-то потерял.

D, A, HENDERSON: Вирусологи и микробиологи часто убирают определенные образцы и как бы забывают, что они у них есть.

БЛОК: Джефф, это не очень обнадеживает. Я имею в виду, что это не просто образец. Это вирус оспы, смертельное смертельное заболевание.

БРУМФИЛ: Ну, сказал мне Хендерсон, вы должны помнить, что это было в 1950-х годах. И оспа по-прежнему остается серьезной болезнью в мире. Итак, вы знаете, тогда исследователи были бы вакцинированы от оспы, как и большая часть населения США. И на самом деле они просто разобрались с этим в открытую. Для них это не было особенно опасно. Хендерсон говорит, что примерно в этом районе он помнит государственную лабораторию, которая называется Отдел биологических стандартов.И это могло быть правительственное учреждение, у которого был этот вирус, хотя, очевидно, это всего лишь предположения. Будет гораздо более тщательное расследование.

БЛОК: Что теперь происходит с этими флаконами с вирусом оспы?

БРУМФИЛ: Что ж, CDC собирается провести с ними еще несколько тестов. Они собираются провести более подробную последовательность ДНК. Они хотят выяснить, действительно ли это могло быть заразным, и они верят, что, вероятно, это могло быть. Похоже, что он хранится в жизнеспособной форме в течение длительных периодов времени.Это также может дать некоторые подсказки относительно того, откуда взялся вирус, хотя в то время люди часто обменивались вирусами между лабораториями. Так что сложно сказать наверняка, смогут ли они точно определить его происхождение. Но в конечном итоге этот вирус будет уничтожен.

БЛОК: А как вы собираетесь уничтожить вирус оспы?

БРУМФИЛ: Ну, один из способов сделать это — автоклавировать — в основном сжечь на очень сильном огне. И это должно навсегда уничтожить вирус.

БЛОК: Это Джефф Брамфил из NPR.Джефф, спасибо.

БРУМФИЛ: Спасибо.

РОБЕРТ ЗИГЕЛЬ, ВЕДУЩИЙ:

Это ВСЕ, РАССМАТРИВАЕМЫЕ от новостей NPR.

Авторские права © 2014 NPR. Все права защищены. Посетите страницы условий использования и разрешений на нашем веб-сайте www.npr.org для получения дополнительной информации.

стенограмм NPR создаются в срочном порядке Verb8tm, Inc., подрядчиком NPR, и производятся с использованием патентованного процесса транскрипции, разработанного NPR. Этот текст может быть не в окончательной форме и может быть обновлен или изменен в будущем.Точность и доступность могут отличаться. Авторитетной записью программирования NPR является аудиозапись.

Научный метод в истории вакцин

Что такое научный метод?

Научный метод — это дисциплинированный, систематический способ задавать вопросы о физическом мире и отвечать на них. Хотя может быть полезно думать о научном методе как о простой серии шагов, на самом деле не существует единой модели научного метода, которая могла бы применяться во всех ситуациях.Скорее, разные научные исследования требуют разных научных методов. Однако определенные качества должны относиться ко всем приложениям научного метода.

Одним из важных качеств научного исследования является то, что оно должно пытаться ответить на вопрос. Другими словами, расследование не должно пытаться «доказать» точку зрения, а должно быть попыткой получить знания. Другое качество состоит в том, что тщательные контролируемые наблюдения должны лечь в основу сбора информации. Наконец, результаты научного исследования должны быть воспроизводимыми: другие исследователи, использующие тот же процесс, должны иметь возможность наблюдать те же результаты.Если результат не воспроизводится, первоначальные выводы следует подвергнуть сомнению.

То, что мы сегодня называем «ступенями» науки, со временем развивалось, и они могут отличаться в зависимости от типа проводимого исследования. Однако, как правило, эти шаги включают в себя наблюдение, формирование гипотезы (упомянутый выше «вопрос»), проведение теста и заключение.

Научные исследования обычно начинаются с наблюдения, которое указывает на интересный вопрос.Один известный пример наблюдения, который привел к дальнейшим исследованиям, был сделан шотландским биологом Александром Флемингом в 1920-х годах. После отсутствия в своей лаборатории он вернулся и начал чистить несколько стеклянных пластин, на которых он выращивал определенный вид бактерий. Он заметил странную вещь: одна из пластин была загрязнена плесенью. Любопытно, что область вокруг плесени выглядела свободной от роста бактерий. Его наблюдение показало, что может существовать причинно-следственная связь: плесень или вещество, производимое плесенью, может предотвратить рост бактерий.Наблюдение Флеминга привело к серии научных тестов, которые привели к новым знаниям: пенициллин можно использовать для лечения бактериальных инфекций.

Гипотеза — это предложение или возможное решение, полученное путем наблюдения. В исследовании Александром Флемингом антибиотических свойств плесени его гипотеза могла быть примерно такой: «Если фильтраты определенного типа плесени ввести в бактерии, бактерии погибнут».

Хорошие гипотезы имеют несколько общих качеств.Во-первых, они обычно начинают с уже имеющихся знаний. То есть они не предлагают идей, которые сильно расходятся с нашими общими знаниями о том, как устроен мир. Кроме того, хорошие гипотезы просты и включают единственную проблему и возможное решение. Наконец, хорошие гипотезы можно проверить и «опровергнуть». То есть предлагаемое решение в гипотезе может быть подвергнуто наблюдаемой проверке, и с помощью этой проверки исследователь может доказать ложность гипотезы. Вышеупомянутая гипотеза, касающаяся исследований Флеминга плесени, опровергнута, потому что тест, в котором бактерии росли в присутствии фильтрата плесени, опровергал бы эту гипотезу, если бы она не была правдой.

Многие современные научные исследования включают тест с контрольной и экспериментальной группами. Другие виды исследований можно проводить с помощью моделирования или исследований и анализа данных. Но в этой статье мы обсуждаем экспериментальное тестирование.

Исследователь проводит эксперимент на контрольной группе так же, как и на экспериментальной группе. Единственное отличие состоит в том, что исследователь не подвергает контрольную группу воздействию единственного тестируемого фактора или вмешательства.Этот единственный проверяемый фактор известен как переменная. Контрольная группа существует, чтобы обеспечить достоверное сравнение с экспериментальной группой.

Например, в эксперименте, проверяющем гипотезу Флеминга, ученый мог ввести фильтраты плесени в культуры бактерий на стеклянных пластинах. Это будет экспериментальная группа. Контрольная группа будет содержать аналогичные культуры бактерий, но без добавления фильтрата плесени. В противном случае обе группы будут подчиняться точно таким же условиям.Любое различие между двумя группами может быть результатом переменной или единственной разницы между ними: внесение фильтрата плесени в бактериальные культуры.

Тщательные наблюдения и регистрация данных имеют решающее значение на этапе тестирования научного метода. Отсутствие точного измерения, наблюдения и записи может исказить результаты теста.

Последний этап научных методов включает анализ и интерпретацию данных, собранных на этапе тестирования.Это позволяет исследователю сделать вывод на основании полученных данных. Хороший вывод учитывает все собранные данные и отразится на гипотезе, независимо от того, поддерживает ли она гипотезу или нет.

Теперь мы рассмотрим различные аспекты научного метода, который использовали различные новаторы при разработке вакцин.

Эдвард Дженнер, родился в Англии в 1749 году, является одним из самых известных врачей в истории медицины.Дженнер проверил гипотезу о том, что заражение коровьей оспой может защитить человека от заражения оспой. Все вакцины, разработанные со времен Дженнера, являются результатом его работы.

Коровья оспа — необычное заболевание крупного рогатого скота, обычно легкое, которое может передаваться от коровы к человеку через язвы на коровьем вымени. Оспа же, напротив, была смертельной болезнью для людей. Он убил около 30% зараженных. У выживших часто были глубокие ямки на лицах и других частях тела, пораженных болезнью.Оспа была основной причиной слепоты.

Говорят, что Дженнер интересовалась наблюдением доярки. Она сказала ему: «У меня никогда не будет оспы, потому что у меня была коровья оспа. У меня никогда не будет уродливого рябого лица ». И многие другие работники молочной фермы обычно считали, что заражение коровьей оспой защищает их от оспы.

Учитывая, что защитный эффект заражения коровьей оспой был общеизвестен на местном уровне, почему участие Дженнер было важным? Дженнер решил систематически проверить это наблюдение, которое затем станет основой практического применения преимуществ инфекции коровьей оспы.

Дженнер нацарапал какой-то материал из язвы коровьей оспы на руке доярки в руку восьмилетнего Джеймса Фиппса, сына садовника Дженнера. Молодой Фиппс несколько дней чувствовал себя плохо, но полностью выздоровел.

Вскоре Дженнер поцарапал что-то из свежей человеческой язвы от оспы на руке Фиппса, пытаясь заразить его оспой. Однако Фиппс не заболел оспой. Дженнер продолжил проверять свою идею на других людях и опубликовал отчет о своих открытиях.

Теперь мы знаем, что вирус, вызывающий коровью оспу, принадлежит к семейству вирусов Orthopox. К вирусам ортопоксии относятся также вирусы натуральной оспы, вызывающие оспу.

Метод вакцинации Дженнер от оспы стал популярным и со временем распространился по всему миру. Примерно через 150 лет после смерти Дженнера в 1823 году оспа будет давать последний вздох. Всемирная организация здравоохранения в конце концов заявила, что оспа на планете полностью ликвидирована в 1980 году после масштабной программы эпиднадзора и вакцинации.

Объяснение научного метода Дженнер показано ниже:

• Наблюдение: Люди, переболевшие коровьей оспой, не заболевают оспой.
• Гипотеза: Если человек был намеренно заражен коровьей оспой, то он будет защищен от заболевания после целенаправленного заражения оспой.
• Тест: Заразить человека коровьей оспой. Тогда попробуйте заразить человека оспой. (Обратите внимание, что Дженнер не использовал контрольную группу в своем эксперименте.)
• Заключение: Заражение человека коровьей оспой защищает от заражения оспой.

Дженнер повторил свой эксперимент несколько раз и получил те же результаты. Другие ученые поступили так же и получили те же результаты. Дженнер известен тем, что применил научный метод к разработке средств профилактики оспы.

Роберт Кох (1843-1910) был немецким врачом, который помог установить бактериологию как науку.Кох сделал важные открытия в идентификации бактерий, вызывающих сибирскую язву, холеру и туберкулез, в то время, когда понимание микробов только зарождалось.

Кох и его коллега Фридрих Лёффлер разработали метод определения возбудителя болезни. Сегодня ученые следуют этим основным принципам, которые мы теперь называем постулатами Коха, пытаясь определить причину инфекционного заболевания. Постулаты Коха основаны на тщательных наблюдениях и воспроизводимости.

1. Микроб присутствует в каждом случае заболевания.
2. Микроб можно взять от хозяина и выращивать самостоятельно.
3. Заболевание может быть вызвано введением чистой культуры микроба здоровому экспериментальному хозяину. *
4. Микроб можно выделить и идентифицировать от хозяина, инфицированного на этапе 3.

* Единственным исключением из шага 3 является то, что некоторые люди могут быть инфицированы болезнетворным микробом и не проявлять признаков болезни. Они известны как бессимптомные носители.

В 1930-х годах Перл Кендрик из Министерства здравоохранения Мичигана разработала вакцину от коклюша, которая, как она надеялась, окажется более эффективной, чем предыдущие вакцины.Важная часть демонстрации эффективности вакцины включала контрольную группу детей, которые не получали вакцину. В то время это было чем-то вроде новшества, но Кендрик знала, что наличие контрольной группы добавит веса ее выводам, если вакцина окажется эффективной. Уровень заболеваемости коклюшем в контрольной группе позволил Кендрик легко продемонстрировать, может ли ее вакцина снизить уровень заболеваемости в экспериментальной группе.

Кендрик отнесла детей к своей экспериментальной группе по коклюшу, если они приходили в клинику для вакцинации от коклюша.Для контрольной группы она произвольно находила детей из списка неиммунизированных детей, который ведется городским отделом здравоохранения. Одна из ошибок, которую мы увидим сегодня в плане эксперимента Кендрика, заключалась в отсутствии рандомизации при отнесении детей либо к экспериментальной, либо к контрольной группе. Рандомизация — это метод использования одного только случая для отнесения субъектов к контрольной или экспериментальной группе. Исследователи используют рандомизацию, потому что это помогает гарантировать, что различия между двумя группами не повлияют на результат эксперимента.Если бы у Кендрик были рандомизированные распределения, она бы минимизировала различия между вакцинированной группой и группой, которую она просто наблюдала.

Несмотря на этот недостаток, исследование Кендрик помогло установить нормы и ожидания в отношении будущих испытаний вакцины и ясно продемонстрировало эффективность ее вакцины.

Полевые испытания инактивированной полиовирусной вакцины (ИПВ) Джонаса Солка в 1954 году стали еще одной важной вехой в использовании научного метода для тестирования вакцины.В этом испытании было задействовано огромное количество субъектов — всего 1,3 миллиона детей — в самом крупном медицинском полевом испытании, которое когда-либо проводилось.

Испытание Солка было тщательно разработанным двойным слепым рандомизированным экспериментом . Это означало, во-первых, что детей случайным образом распределяли либо в контрольную, либо в экспериментальную группу. «Двойной слепой» означает, что никто — ни ребенок, ни родитель, ни человек, сделавший инъекцию, ни лицо, оценившее состояние здоровья ребенка, — не знают, получил ли конкретный ребенок вакцину от полиомиелита или инъекцию плацебо.(Плацебо — это неактивное вещество. В данном случае плацебо представляло собой раствор соленой воды.) Информация о том, получил ли ребенок вакцину или плацебо, была закодирована цифрами на флаконах, из которых был взят введенный материал, и была связана к записи ребенка. Только после окончания периода наблюдения и регистрации результата — развился ли у ребенка полиомиелит во время периода наблюдения или нет? — обнаруживался экспериментальный или контрольный статус ребенка.

Власти не достигли двойного слепого рандомизированного стандарта на протяжении всего испытания вакцины против полиомиелита.В некоторых общинах официальные лица возражали против использования инъекций плацебо, поэтому детей в контрольной группе просто наблюдали на предмет признаков полиомиелита. Эти группы были известны как наблюдаемые контрольные. Некоторые разработчики исследования беспокоились, что различия между наблюдаемой контрольной и экспериментальной группами могут повлиять на результат. Например, наблюдаемая контрольная группа включала детей, родители которых не соглашались на вакцинацию. Были ли существенные различия, такие как доход, жилье или возраст родителей, между детьми, родители которых не соглашались, и теми, кто соглашался? И могут ли эти различия повлиять на то, подвергались ли дети уже заражению полиомиелитом и стали ли они невосприимчивыми к нему?

Испытания вакцины Солка успешно показали, что вакцина помогла предотвратить паралитический полиомиелит, и вскоре последовало лицензирование вакцины.Болезнь, которая когда-то парализовала тысячи детей, теперь ликвидирована в Западном полушарии.

История научного метода исследования вакцин привела к сегодняшнему тщательно регулируемому процессу разработки вакцины. С годами стандарты для исследований вакцин становились все более строгими, чтобы контрольные группы и группы вакцины были максимально похожи друг на друга. Принципы контроля, ослепления и рандомизации играют ключевую роль при тестировании вакцин.Для получения дополнительной информации см. Статью «Разработка, тестирование и регулирование вакцин».

Программа открытых коллекций библиотеки Гарвардского университета. Инфекция: исторические взгляды на болезни и эпидемии. Дата обращения 17.01.2018.

Кендрик П., Элдеринг Г. Исследование активной иммунизации против коклюша. Американский журнал гигиены 29: 133-153.

Marks, H.M. Полевые испытания вакцины Солка от полиомиелита в 1954 году. Клинические испытания .2011 Апрель; 8 (2): 224-34. Дата обращения 17.01.2018.

Marks, H.M. Полевые испытания коклюшной вакцины Кендрика-Элдеринга (Фрост). Библиотека Джеймса Линда. 2006. Дата обращения 17.01.2018.

Ошинский, Д. Полиомиелит: американская история. Нью-Йорк: Oxford University Press, 2005.

Сэр Александр Флеминг: вопросы и ответы. Nobelprize.org. Дата обращения 17.01.2018.

Чтобы читать PDF-файлы, загрузите и установите Adobe Reader .

Последнее обновление 17 января 2018

наборов для вакцинации против оспы времен гражданской войны в США выявили исторический вирус

Донна Лу

Обнаружены следы штаммов вирусов, использовавшихся для вакцинации против оспы во время гражданской войны в США

Alamy Stock Photo

штаммов вирусов, использовавшихся в вакцинах против оспы в США во время гражданской войны, и реконструированы их геномы.

«Успешное искоренение оспы с помощью вакцинации показывает решающее значение, которое эта практика имела в истории человечества», — говорит Ана Дагган, возглавлявшая группу исследователей по анализу противооспенных вакцин в Университете Макмастера в Канаде.

Оспа, вызванная вирусом натуральной оспы, унесла жизни примерно 30 процентов инфицированных. Он был официально ликвидирован в 1980 году после согласованных глобальных усилий по вакцинации.

Ранние методы защиты от оспы включали заражение людей родственными вирусами, чтобы вызвать более легкий случай заболевания, в результате которого они были бы заражены против натуральной оспы.Обычно это делалось путем нанесения инфицированного гноя или струпьев на порез на коже — процесс, известный как вариоляция.

Дагган и ее коллеги собрали генетический материал из наборов для вакцинации времен гражданской войны в США, чтобы идентифицировать вирусы, которые использовались для вакцинации против оспы в то время. Команда проанализировала пять наборов из музейной коллекции, которые использовались врачами в районе Филадельфии с середины до конца 19 века.

Наборы содержали ланцеты, жестяные коробки, в которых хранился струп, и маленькие стеклянные пластинки для смешивания жидкости, взятой из волдырей инфицированных людей.

Команда реконструировала геномы всех присутствующих вирусов, проанализировав струпья и высушенный материал на волдырях из четырех наборов. В одном наборе, который не содержал прямых доказательств наличия биологического материала, исследователи замачивали жестяную коробку в растворе с ферментами, которые, по сути, поглощают фрагменты вируса, не повреждая коробку.

Все пять идентифицированных вирусов были штаммами вируса коровьей оспы, который лишь отдаленно родственен натуральной оспе и является причиной коровьей оспы. Ни один из вирусных генетических материалов не был неповрежденным, что означает, что он не был заразным.Затем команда объединила вирусные фрагменты, как мозаику, с помощью компьютерного алгоритма, а также генетической последовательности интактного вируса осповакцины в качестве эталона.

По словам Даггана, все ранее идентифицированные штаммы натуральной оспы с 1940-х по 1970-е годы были на удивление похожими, даже несмотря на то, что они были распространены по всему миру. «Это сокращение разнообразия в 20-м веке почти наверняка было ответом на повсеместную вакцинацию», — говорит она.

Исследование иллюстрирует усилия, которые прилагались к вакцинации почти за 200 лет до того, как оспа была искоренена, — говорит Дагган.

Ссылка на журнал: Genome Biology , DOI: 10.1186 / s13059-020-02079-z

Дополнительная информация по этим темам:

Вирус оспы — обзор

Оспа

Вирус натуральной оспы стабилен и сохраняет свою инфекционность в течение длительного времени вне хозяина. ²³ Вирус натуральной оспы заразен аэрозолем, ³ , но естественное воздушно-капельное распространение, за исключением тесных контактов, является необычным. ^24,25 Примерно 30% восприимчивых контактов заразились в эпоху эндемической оспы, ²⁶ и кампания ВОЗ по ликвидации была основана на требовании непосредственной близости от человека к человеку для надежной передачи.Тем не менее две больничные вспышки продемонстрировали, что вирус натуральной оспы может передаваться воздушно-капельным путем в условиях низкой относительной влажности. ²⁷ Пациенты во время этих вспышек были заразными с момента появления высыпаний, чаще всего с 3-го по 6-й день после начала лихорадки. Если у пациента был кашель, шансы передачи инфекции значительно увеличивались. Непрямая передача через зараженную подстилку или другие фомиты наблюдалась нечасто. Некоторые люди, находящиеся в тесном контакте с пациентами, содержат вирус в горле без развития болезни и, возможно, несут ответственность за вторичную передачу. ²⁸

После контакта с вирусом в аэрозольной форме, натуральная оспа перемещается из верхних или нижних дыхательных путей в региональные лимфатические узлы, где она воспроизводится и вызывает виремию, за которой следует сыпь. ²⁹ Инкубационный период оспы в среднем составляет 12 дней (от 9 до 14 дней). Во время глобальной ликвидации всех, кто контактировал с инфицированными пациентами, помещали в карантин как минимум на 16-17 дней после заражения. Аналогичные рекомендации относятся к плану реагирования Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) на повторное появление оспы (www.bt.cdc.gov/agent/smallpox/response-plan). После заражения респираторным путем и репликации в местных лимфатических узлах вирус натуральной оспы системно распространяется в другие лимфоидные ткани, селезенку, печень, костный мозг и легкие. В течение этого бессимптомного продромального периода вирус натуральной оспы может быть выделен из крови, но этот показатель ниже, чем на более поздних стадиях болезни. Клинические проявления начинаются остро с недомогания, лихорадки, озноба, рвоты, головной боли и боли в спине; У 15% пациентов развивается делирий.Примерно у 10% светлокожих пациентов на этой стадии появляется эритематозная сыпь. Еще через 2–3 дня энантема появляется одновременно с дискретной сыпью на лице, руках и предплечьях. Из-за отсутствия кератинового слоя на слизистых оболочках поражения выделяют инфицированные эпителиальные клетки и вызывают инфекционные ротоглоточные выделения в первые несколько дней эруптивного заболевания, а иногда и за 24 часа до высыпания. ³⁰ Эти респираторные выделения являются наиболее важным, но не единственным средством передачи вируса.После последующих высыпаний на нижних конечностях сыпь в течение следующей недели распространяется централизованно на туловище. Поражения быстро прогрессируют от пятен к папулам и, в конечном итоге, к пустулезным пузырькам ( Рис. 57.1 ). Поражения более многочисленны на конечностях и лице, и это центробежное распределение является важным диагностическим признаком. В отличие от поражений, наблюдаемых при ветряной оспе, очаги оспы на различных сегментах тела в целом остаются синхронными на стадии своего развития.Через 8–14 дней после начала пустулы образуют корки, которые при заживлении оставляют депрессивные депигментированные рубцы. Хотя титры вируса натуральной оспы в горле, конъюнктиве и моче со временем снижаются, вирус ² можно легко выделить из корочек на протяжении всего периода выздоровления. ³¹ Таким образом, пациенты должны быть изолированы и считаться заразными до тех пор, пока все струпья не отделятся.

Две различные формы оспы были признаны в прошлом веке оспы. Variola major, высоковирулентная, прототипическая и исторически значимая форма болезни, оставалась распространенной в Азии и некоторых частях Африки в течение двадцатого века.Малая натуральная оспа отличалась меньшей системной токсичностью и более мелкими поражениями при оспе. ²⁹ Однако Диксон сообщил о многих случаях, неотличимых от вируса натуральной оспы, в своем обширном сравнении типов поражений. ³² Корте впервые описал малую оспу, первоначально в Африке, в 1904 году. Чапин обнаружил аналогичную легкую форму, известную как аластрим, которая возникла в Северной Америке еще в 1896 году и впоследствии была зарегистрирована в Южной Америке, Европе и Австралии. Два различных штамма вируса с пониженной вирулентностью вызывали малую оспу и аластрим, и оба обычно вызывали 1% -ную смертность у невакцинированных лиц. ^11,29

В классификации Рао указаны пять клинических проявлений натуральной оспы. ³³ Три четверти случаев заболевания вирусом натуральной оспы относились к классическому или обычному типу. После появления продромальной лихорадки и конституциональных симптомов у пациентов развивалась типичная сыпь натуральной оспы, центробежная по распределению, с синхронным прогрессированием от пятен к папулам, от пузырьков к пустулам, а затем к струпьям. Летальность составила 3% у вакцинированных пациентов и 30% у невакцинированных.Другие клинические проявления оспы встречались реже, вероятно, из-за различий в иммунном ответе хозяина. Оспа плоского типа, отмеченная у 2–5% больных оспой, характеризовалась как тяжелой системной токсичностью, так и медленным развитием плоских мягких очаговых поражений кожи, не похожих на классическую экзантему натуральной оспы. Этот синдром вызвал 66% смертности вакцинированных и 95% невакцинированных пациентов. Менее 3% больных оспой заболевали оспой геморрагического типа, которая сопровождалась обширными петехиями, кровоизлиянием в слизистые оболочки и сильной токсемией; смерть обычно наступала до того, как развились типичные очаги оспы. ³⁴ Однако иногда геморрагическая оспа также возникала при классическом типе оспы на более позднем этапе болезни. Оспа как геморрагического, так и плоского типа могла указывать на лежащий в основе иммунодефицит; геморрагические формы чаще встречались у беременных женщин и детей раннего возраста. ³⁵ Модифицированный тип , , который обычно встречался, но не исключительно, у ранее вакцинированных лиц, характеризовался ослаблением конституциональных симптомов, обычно уменьшенным количеством поражений и быстрым развитием поражений с образованием корок к девятому дню болезни. . Variola sine eruptione характеризовалась продромальной лихорадкой и конституциональными симптомами. У этих пациентов, большинство из которых были вакцинированы, сыпь никогда не появлялась. ³³ На самом деле проявления инфекции натуральной оспы распределяются по целому спектру, и классификация проводится в первую очередь с целью прогноза.

Бактериальная суперинфекция очагов оспы была относительно обычным явлением в до-антибиотическую эпоху, особенно в условиях отсутствия надлежащей гигиены и медицинской помощи и в тропической среде. ² Артрит и остеомиелит развиваются на поздних стадиях болезни примерно у 1-2% пациентов, чаще возникают у детей и часто проявляются двусторонним поражением суставов, особенно локтей. ³⁶ Тельца включения вируса могут быть обнаружены в суставном выпоте и костном мозге пораженной конечности. Иногда сообщалось о кашле и бронхите как о явных проявлениях оспы, что имеет значение для распространения инфекции; однако пневмония была необычной. ² Отек легких часто возникал при геморрагической и плоской оспе. Орхит отмечен примерно у 0,1% пациентов. Энцефалит развился в 1 из 500 случаев оспы. Кератит и язвы роговицы были серьезными осложнениями оспы, прогрессирующими до слепоты чуть менее чем в 1% случаев. Заболевание во время беременности привело к высокой перинатальной смертности, также была выявлена ​​врожденная инфекция.

Частичный иммунитет, вызванный вакцинацией, привел к оспе модифицированного типа, при которой редкие кожные поражения развивались по-разному, часто без пустул и быстро, с образованием корок уже на седьмой день болезни.При контакте с оспой у некоторых полностью иммунных людей развилась лихорадка, боль в горле и конъюнктивит (так называемая контактная лихорадка), которые продолжались несколько дней, но не вызывали токсичности или незначительных кожных повреждений, которые указывают на сыпь натуральной оспы . Лица, вылечившиеся от оспы, обладали длительным иммунитетом, хотя второй приступ мог случиться у 1 из 1000 человек после промежуточного периода в 15–20 лет. ³⁶ Считается, что гуморальные и клеточные реакции являются важными компонентами выздоровления от инфекции.Нейтрализующие антитела достигают пика через 2–3 недели после начала заболевания и длятся более 5 лет, ³⁷ до нескольких десятилетий у некоторых людей. ¹⁵

Раннее производство противооспенной вакцины в США: внедрение «вакцины для животных» в 1870 г., создание «ферм по производству вакцин» и начало производства вакцин

Основные моменты

•

Производство противооспенной вакцины в конце 19 века положило начало производству вакцин в Соединенных Штатах.

•

Нет информации о запасах или семенных вирусах, используемых для производства этих ранних вакцин.

•

Историческая информация позволит лучше понять происхождение и эволюцию вакцины, используемой для искоренения оспы.

Реферат

В течение первых 80–90 лет после открытия вакцины Дженнером в 1796 году основной стратегией, используемой для распространения и поддержания вакцины против оспы, была вакцинация от руки к руке, также известная как вакцинация Дженнером или гуманизированная вакцинация.Значительный прогресс произошел после 1860 года с разработкой так называемой «вакцины для животных», которая относилась к выращиванию вакцинного материала путем серийного размножения телят перед использованием на людях. Использование «вакцины для животных» имело несколько преимуществ по сравнению с вакцинацией от руки к руке: она не передавала сифилис или другие заболевания человека, обеспечивала поставку вакцины даже при отсутствии спонтанных случаев коровьей или конской оспы и это позволило производить большое количество вакцины.Концепция «вакцины для животных» была введена в США в 1870 году Генри Остином Мартином. Очень быстро в США было создано несколько «вакцинных ферм», которые произвели большое количество «вакцины для животных». Эти «фермы по производству вакцин» в основном создавались врачами, которые видели возможность удовлетворить растущий спрос на вакцину против оспы со стороны отдельных лиц и органов здравоохранения и получить прибыль. «Фермы по производству вакцин» эволюционировали от производства только противооспенной «вакцины для животных» к производству нескольких других биопрепаратов, включая дифтерийные и другие антитоксины.Два крупных случая заражения столбняком произошли в 1901 году, что привело к обнародованию Закона о контроле за биологическими препаратами 1902 года. Министр финансов США выдал лицензии на производство и продажу биологических препаратов, в основном вакцин и антитоксинов. В результате нескольких слияний и поглощений первоначальные лицензиаты биологических препаратов в конечном итоге превратились в некоторые из нынешних крупных американских компаний, производящих вакцины. Важным аспектом, который так и не был прояснен, был источник запасов вакцины, используемых для производства противооспенных «вакцин для животных».Скорее всего, различные запасы противооспенной вакцины неоднократно вводились из Европы, в результате чего были получены поликлональные вакцины, которые в настоящее время считаются «вариантами», а не «штаммами». Кроме того, клональный анализ современных «вакцин для животных» показывает, что они, вероятно, получены в результате сложных рекомбинационных событий между различными штаммами оспы и коровьей оспы. В настоящее время мы используем современные технологии секвенирования для изучения старых образцов противооспенной вакцины, чтобы лучше понять происхождение и эволюцию вакцин, которые использовались для искоренения оспы.

Ключевые слова

Антитоксин против дифтерии

Оспа

Вакцина против оспы

Ферма вакцины

Промышленность вакцин

Вакцина

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Автор. Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Изучение возможности заражения вирусом натуральной оспы макак яванских макак в качестве модели оспы человека

Аннотация

Вирус оспы (натуральной оспы) представляет серьезную угрозу как возбудитель биотерроризма.Чтобы снизить этот риск, срочно необходимы противовирусные препараты и улучшенная вакцина. Удовлетворительная демонстрация защитной эффективности против натуральной натуральной оспы потребует разработки модели на животных, в которой натуральная оспа вызывает течение болезни с характеристиками, соответствующими натуральной оспе человека. С этой целью макаки cynomolgus подвергались воздействию нескольких штаммов натуральной оспы через аэрозоль и / или внутривенно. маршруты. Два штамма, Harper и India 7124, вызывали одинаковую острую летальность при внутривенном введении. в высоких дозах (10 ⁹ бляшкообразующих единиц).Более низкие дозы приводили к менее фульминантным системным заболеваниям и более низкой смертности. У умерших животных был выраженный лейкоцитоз, тромбоцитопения и повышенный уровень креатинина в сыворотке. После инокуляции оспа была диссеминирована посредством моноцитарной клеточно-ассоциированной вирусемии. Распределение вирусных антигенов с помощью иммуногистохимии коррелировало с присутствием реплицирующихся вирусных частиц, продемонстрированных электронной микроскопией, и патологией в лимфоидных тканях, коже, слизистой оболочке полости рта, желудочно-кишечном тракте, репродуктивной системе и печени.Эти частицы напоминали частицы оспы человека. Высокая вирусная нагрузка в тканях-мишенях была связана с дисфункцией органов и мультисистемной недостаточностью. Свидетельства активации каскада свертывания (D-димеры) подтвердили гистологические свидетельства геморрагического диатеза. Истощение Т-клеточно-зависимых областей лимфоидных тканей произошло, вероятно, как следствие сторонних апоптотических механизмов, инициированных инфицированными макрофагами. Выработка цитокинов, включая IL-6 и IFN-γ, вносит свой вклад в цитокиновый шторм, ранее известный как «токсемия».«Более точное понимание патогенеза заболевания должно обеспечить цели для терапевтического вмешательства, которое будет использоваться отдельно или в сочетании с ингибиторами репликации вируса натуральной оспы.

S Оспа широко считается серьезной угрозой биотерроризма (1). По иронии судьбы, неожиданным последствием глобальной кампании Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по искоренению оспы (2) стало создание в значительной степени уязвимого населения; в Соединенных Штатах плановая вакцинация против оспы была прекращена в 1976 году.Чтобы смягчить приступ оспы, серьезное внимание уделяется вакцинации больших слоев населения; однако обычная вакцинация вызывает значительную частоту побочных реакций, и, таким образом, исключается ряд слоев населения. Необходимость в защитной, но менее реактогенной вакцине очевидна, и весьма желательно наличие противовирусного препарата для лечения лиц, подвергшихся воздействию вируса оспы (натуральной оспы).

Для удовлетворения этих исследовательских потребностей работа с этим вирусом была рекомендована U.Исследовательская группа Института медицины S. в 1999 г. (3), и план исследований был одобрен ВОЗ в соответствии с Резолюцией 52.10 (4) ВОЗ по разработке животной модели с использованием аутентичного вируса натуральной оспы. Обоснованием этой инициативы было выполнение требований правила эффективности животных (5) Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), которое было установлено для облегчения утверждения терапевтических стратегий и вакцин для микробных агентов в тех случаях, когда получение препарата нецелесообразно или неэтично. данные об эффективности у людей.В случае вируса оспы, который больше не встречается в человеческих популяциях, единственный вариант продемонстрировать защитную эффективность — это модель на животных. Правило FDA по эффективности животных требует, чтобы использовался подлинный агент (в данном случае, натуральная оспа) и чтобы процесс заболевания соответствовал человеческому заболеванию. Конечная точка исследования должна основываться на снижении заболеваемости или смертности. При оценке мер противодействия оспе соблюдение этих требований особенно сложно. В природе нет животных-резервуаров вируса натуральной оспы, и большинство видов животных невозможно заразить даже в лаборатории (2).Попытки разработать на приматах модели инфекции и болезни натуральной оспы в 1960-х годах имели лишь ограниченный успех (6, 7). Однако модифицированный штамм осповакцины Ankara был лицензирован в то время для использования в Германии на основании уменьшения симптоматики у приматов, подвергшихся воздействию натуральной оспы (8). Воодушевленная этими новаторскими исследованиями, наша межведомственная группа (9) попыталась создать смертельную модель настоящей натуральной оспы, подвергнув макак яванского макака воздействию ряда штаммов натуральной оспы в высоких дозах различными путями.Первоначальным ограничением, установленным Резолюцией 52.10 ВОЗ, было завершение этой работы до декабря 2002 г. В предварительных сообщениях (9, 10) мы сообщили о результатах воздействия на две группы обезьян штаммов Yamada и Lee, вводимых в виде мелкодисперсных аэрозолей. (аналогично нападению с применением биологического оружия). Ни у одной из обезьян, подвергшихся воздействию наивысшей достижимой дозы аэрозоля [10 ^8,5 бляшкообразующих единиц (БОЕ)] любого штамма, не развилось серьезное заболевание, хотя все подвергшиеся воздействию животные действительно заразились.В связи с быстрым приближением крайнего срока ВОЗ в декабре 2002 г., нашей первоочередной задачей было выявление системного заболевания; Таким образом, мы выбрали два дополнительных штамма натуральной оспы (Harper и India 7124) и подвергли обезьян воздействию как аэрозольного вируса (10 ⁸ БОЕ), так и внутривенного введения. прививка (10 ⁹ БОЕ) для максимального увеличения вероятности развития серьезного системного заболевания с признаками человеческой оспы. Мы достигли этой цели, хотя для более точного моделирования всего спектра заболеваний человека требуются дальнейшие разработки.Эти начальные испытания, а также последующие исследования развития с использованием i.v. только маршрут, являются предметом данного отчета.

Материалы и методы

Воздействие на обезьян вариолу. Тридцать шесть обезьян cynomolgus ( Macaca fascicularis ) подверглись воздействию одного из двух штаммов натуральной оспы, Harper и India 7124. Перед включением в исследование все животные были клинически здоровыми и имели отрицательные результаты тестов на обезьяний ретро-вирус, вирус обезьяньего Т-клеточного лейкоза. , вирус обезьяньего иммунодефицита и антитела против вируса коровьей оспы; оба посевного материала натуральной оспы были приготовлены как материалы третьего пассажа из хориоаллантоисных мембран в клетках BSC-40 и обработаны, как описано в вспомогательном тексте , который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.Аэрозоли содержали частицы размером от 1 до 3 мкм, как описано для вируса оспы обезьян (11). Использование i.v. облучение проводилось через бедренную вену в объеме 1,0 мл. Восемь животных заражали комбинацией аэрозоля и внутривенного введения. инокуляция, четыре штамма Harper и четыре штамма India. Дополнительных животных подвергали внутривенному воздействию. к одному вирусу в различных дозах (таблица 1). Животных осматривали ежедневно после воздействия. Во время исследования животным вводили седативную терапию комбинацией тилетамин-золазепам (3-6 мг / кг, т.м. с телазолом, А.Х. Роббинс, Ричмонд, Вирджиния) и брали кровь с интервалом в 2-3 дня для гематологии, клинической химии, серологии и выделения вируса. Все эксперименты на животных, проведенные для этого исследования, соответствовали рекомендациям Национального института здоровья.

Гематология, тесты на коагуляцию и биохимия. Общее количество лейкоцитов, дифференциальное количество лейкоцитов, количество красных кровяных телец, количество тромбоцитов, гематокрит, общий гемоглобин, средний объем клеток, средний корпускулярный объем и средние концентрации корпускулярного гемоглобина были определены из образцов крови, собранных в ЭДТА, с использованием Акт 10 Coulter Counter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Химический состав сыворотки определяли с помощью анализатора крови Piccolo (Abaxis, Саннивейл, Калифорния). Уровень D-димеров (продуктов разложения фибрина) исследовали с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Asserachrom D-Di, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ).

Производство цитокинов / хемокинов. Уровни IFN-α, IFN-γ, фактора некроза опухоли α, IL-6, хемоаттрактантного белка моноцитов 1, воспалительного белка макрофагов 1α и воспалительного белка макрофагов 1β в сыворотке / плазме обезьян анализировали с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителя (BioSource International, Камарильо, Калифорния).

Вскрытие трупа. Полные вскрытия трупов были выполнены у всех животных либо сразу после смерти от инфекции, либо после гуманного умерщвления неизлечимо больных или умирающих животных в соответствии с установленными руководящими принципами.Животных, которые заболели клинически и впоследствии выздоровели, умерщвляли и вскрывали через 21 день после контакта. Ткани всех основных органов были собраны для гистопатологии и иммуногистохимии.

Гистология, иммуногистохимия и окрашивание, опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP Nick End Labeling (TUNEL). Ткани, которые фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин на минимум 48 часов, подвергали 2 × 10 ⁶ рад в облучателе ⁶⁰ Co для обеспечения инактивации вирусов.Вирусный антиген был иммуногистохимически локализован с помощью поликлонального антитела, направленного против вируса осповакцины (любезно предоставленного B. Moss, Национальные институты здравоохранения, Bethesda), с использованием ранее описанных методов и фиксированных формалином, залитых парафином тканей (12-14). Клетки-мишени идентифицировали с помощью поликлональных вакцинных антител в сочетании с различными клеточными маркерами. Антитела к фактору фон Виллебранда использовали в качестве маркеров эндотелиальных клеток, а маркер поликлональных макрофагов, Ab-1 (Oncogen Research Products, Сан-Диего), использовали для идентификации моноцитов / макрофагов.Апоптотические клетки выявляли с помощью анализа TUNEL (Apoptag, Intergen, Purchase, NY). Отобранные клетки-мишени были идентифицированы с использованием маркера пан-В-клеток, CD20 (DAKO), маркера пан-Т-клеток, CD3 (DAKO), маркера поликлональных макрофагов или маркера эндотелиальных клеток (фактор фон Виллебранда, DAKO) в сочетании с Тест TUNEL. Наличие апоптотических клеток в тканях подтверждено ультраструктурным исследованием.

Ультраструктура. Ткани, собранные для ультраструктурного исследования, зафиксированы в 2.5% глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,3), облучили (5 × 10 ⁶ рад) и обработали, как описано (14). Вырезали ультратонкие срезы, помещали на медные сетки для электронной микроскопии с размером ячеек 200 меш, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips.

Выделение вируса из крови и тканей. Инфекционный вирус в тканях и циркулирующих клетках анализировали путем подсчета бляшек на монослоях Vero-E6, как описано (15).Вкратце, на монослои клеток Vero E6 накладывали серийные разведения 10% гомогенатов органов или суспензий разрушенных клеток. После 1-часовой абсорбции среду заменяли, и планшеты инкубировали в течение 3-4 дней и окрашивали 1,3 мг / мл кристаллического фиолетового, 5% этанола и 30% формалина. Через 20 мин планшеты промывали и сушили и подсчитывали шесть бляшек.

Результаты

В отличие от предыдущего опыта (9), оба штамма натуральной оспы вызвали быстрое молниеносное заболевание с почти одинаковой летальностью и поражениями на конечной стадии, напоминающими человеческое заболевание, у обезьян, подвергшихся воздействию комбинации аэрозоля и i.v. маршруты. Три из четырех обезьян, подвергшихся воздействию штамма Harper, умерли (дни 4, 4 и 6), и все четыре обезьяны, подвергшиеся воздействию штамма India 7124, погибли (дни 3, 3, 4 и 13) (см. Таблицу 2, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Чтобы определить, есть ли в / в. Одной инокуляции было достаточно для получения летальности, мы инокулировали еще четырех обезьян штаммом India (10 ⁹ БОЕ внутривенно) и получили однородную летальность (дни 3, 3, 4 и 6). Таким образом, мы продемонстрировали фундаментальное наблюдение о том, что можно добиться летального заражения приматов с помощью вируса натуральной оспы.Чтобы определить, вызывают ли более низкие дозы вируса менее быстрое течение болезни, мы титровали штамм India на летальность для обезьян, подвергая животных в / в. до различных 10-кратных разведений. В этой серии умерла только одна из двух обезьян, получивших 10 ⁹ БОЕ; ни один из тех, кто получил 10 ⁸ БОЕ или более низкие дозы, не умер, хотя серьезность объективных маркеров болезни действительно снизилась в зависимости от дозы (см. ниже). Точно так же штамм Harper был равномерно летальным при 10 ⁹ БОЕ i.v., но только одно из трех животных погибло при дозе, в 10 раз меньшей (таблица 1).

Общие показатели лейкоцитов в периферической крови были заметно повышены у обезьян, умерших остро; дифференциальный подсчет выявил моноцитоз> 20% у тех, кто умер до 6 дня (рис. 1 a ). Пик лейкоцитоза наступил позже у обезьян, которые жили дольше. Временное снижение количества тромбоцитов наблюдалось у всех остро инфицированных животных, хотя редко до уровней <100000 на микролитр (рис.1 б ). Инфекционный вирус выделяли из моноцитов периферической крови в течение 2 дней после инокуляции, но никогда в бесклеточной плазме. Титры варьировались от 10 ² до 10 ⁶ БОЕ на 10 ⁶ клеток и со временем увеличивались. Инфекционный вирус также был легко выделен из мазков из ротоглотки (рис. 1 c ). В то время как мазки, полученные сразу после воздействия аэрозоля, могли содержать инокулят вируса, титры после 3-го дня, вероятно, представляли потомство, реплицирующееся в глотке, как и титры от животных, инокулированных i.v. в еще более ранние моменты времени.

Общее количество лейкоцитов у обезьян, инфицированных штаммами оспы Harper и India ( a ), количество тромбоцитов в плазме от инфицированных обезьян ( b ), титры инфекционных вирусов, полученные из мазков из горла инфицированных обезьян ( c ), и количество поражений кожи в зависимости от дозы вируса (штамм India) ( d ).Оценка поражений: 3,> 500 очагов поражения; 2, 50-500 очагов поражения; 1, 1-50 очагов.

Клинически у этих обезьян кожная эритема и кожное кровоизлияние наблюдались уже на 2-й день. На 3-й день становилось очевидным раннее развитие пузырьков и пустул. У всех животных в течение 3 дней развилась лихорадка, за которой последовали анорексия, кашель и поражения кожи, характеризующиеся центробежным распределением с концентрацией на конечностях. Многие из этих особенностей напоминали те, что описаны у людей в прошлом.Количество кожных повреждений менялось в зависимости от дозы. У животных, которые подверглись воздействию самых высоких доз вируса (10 ⁹ и 10 ⁸ БОЕ) и которые жили после 7-го дня, постоянно развивалось более 500 поражений (рис. 1 d ). ). При аутопсии, помимо кожного кровоизлияния, наблюдались признаки коагулопатии, которые включали геморрагические выпоты в грудной и брюшной полостях и передней камере глаза, в дополнение к висцеральным и слизистым кровоизлияниям.

Значения клинического химического состава обезьян, привитых штаммами натуральной оспы Harper или India, приведены по дням для отдельных животных (таблицы 3 и 4, которые публикуются в качестве дополнительной информации на веб-сайте PNAS). Уровни трансаминаз в сыворотке заметно повысились к 4-му дню у обезьян, подвергшихся воздействию штамма India; Азот мочевины крови и креатинин также были заметно повышены в периоды, предшествующие смерти. Устойчивое снижение уровня сывороточного альбумина при стабильных значениях общего белка свидетельствует о синдроме утечки капилляров.

Патологоанатомические исследования были проведены на всех животных. Оценка инфекционной вирусной нагрузки в органах обезьян при вскрытии выявила титры вирусов, значительно превышающие инокулят, от 10 ⁵ БОЕ / г мозга до> 10 ⁹ БОЕ / г в надпочечниках, почках, селезенке и печени. . Подробный отчет о патологических находках будет представлен отдельно (M.J.M., L.E.H., J.W.H., W. Shieh, S. Zaki и P.B.J., неопубликованная работа). Короче говоря, многие органы демонстрировали признаки диффузных петехиальных кровоизлияний на серозных поверхностях (рис.2 а ), а также сильную гиперемию и кровоизлияние на поверхности слизистых оболочек, часто в сочетании с геморрагическими, колическими лимфатическими узлами (рис. 2 b ). Везикулярные и пустулезные образования прорезывались синхронно центробежно, более многочисленные на конечностях, чем на туловище (рис.2 c и d ). Пустулы также развивались на лице, и в конечном итоге они образовывались и высыхали у животных, живших более 7 дней (рис.2 и ).

Крупные поражения, связанные с заражением обезьян вирусом оспы. ( a ) Кровоизлияние на серозную поверхность дистального отдела толстой кишки, обезьяна I-7, через 6 дней после воздействия. Обратите внимание на диффузные петехиальные кровоизлияния и геморрагические, колические лимфатические узлы.( b ) Поверхность слизистой оболочки дистального отдела толстой кишки, описанная в a . Обратите внимание на сильную заложенность, кровотечение и геморрагические колики в лимфатических узлах. ( c ) Медиальная поверхность правой руки обезьяны I-4 через 9 дней после воздействия. Пустулы оспы преимущественно дискретные, время от времени сливающиеся. Повреждения Pock развивались синхронно и были более многочисленными дистально, что согласуется с центробежным распределением. ( д ). Ладонная поверхность левой руки обезьяны через 11 дней после облучения.Отдельные и сливающиеся пустулы сохранили целостность благодаря сильно ороговевшему ладонному и пальцевому эпидермису. ( e ) Верхняя губа и ноздри яванского макака через 11 дней после контакта. Обратите внимание на синхронное развитие пустул, некоторые из которых имеют пупок. Пустулы, образовавшиеся на слегка ороговевших поверхностях слизистой оболочки ноздрей, уже изъязвлены, что приводит к высыханию экссудата.

На микроскопическом уровне истощение лимфоцитов и дегенерация гепатоцеллюлярных и почечных канальцев были согласованными результатами.Также присутствовали отложение фибрина, тромбы и системный апоптоз лимфоцитов с вовлечением вторичных лимфоидных органов. Гистопатологическое исследование кожных поражений выявило дегенерацию и некроз эпителия, меж- и внутриклеточный отек, а также образование микровезикул и микропустул, типичных для экзантемы человека (рис. 3 a ). Антигены натуральной оспы были локализованы в клетках Купфера и гепатоцитах в печени (рис. 3 b ), а также в проксимальных и дистальных канальцах почек (рис.3 с ). Электронная микроскопия показала репликацию вируса в большинстве исследованных висцеральных тканей, особенно в лимфатических узлах и селезенке, а отложение фибрина часто было связано с инфицированными макрофагами в селезенке (рис. 3 d ). Зависимые от Т-лимфоцитов области лимфоидных тканей, как правило, были истощены, тогда как соседние макрофаги были продуктивно инфицированы.

Микроскопическая локализация вируса оспы в тканях инфицированных обезьян. ( a ) Иммуногистохимическая локализация антигена натуральной оспы в кожном эпидермисе в связи с гидропической дегенерацией и микровезикулами, день 3. ( b ) Локализация вариолы в гепатоцитах и ​​клетках Купфера (стрелка) печени, день 6. ( c ) Антиген натуральной оспы в ассоциации с проксимальными и дистальными канальцами почек, день 6. ( d ) Электронная микрофотография гистиоцитарных клеток в селезенке с доказательством репликации вируса в ассоциации с пластинчатыми мембранными телами и межклеточным фибрином.

Иммунофлуоресцентное исследование этих тканей выявило антигены натуральной оспы, связанные с моноцитами / макрофагами в лимфоидных тканях (рис. 4 a ) и в обращении. Помимо моноцитов / макрофагов, легко наблюдались инфицированные вирусом эндотелиальные клетки (рис. 4 b ). Окрашивание на моноциты / макрофаги (зеленый) и апоптоз (красный) выявило присутствие многочисленных макрофагов с покалывающими телами.Большинство апоптотических клеток были не моноцитами / макрофагами, а лимфоцитами. Был визуализирован редкий апоптотический моноцит / макрофаг (рис. 4 c ), и наблюдался моноцит / макрофаг с четко окрашенным неапоптотическим ядром (синий), охватывающий два отдельных апоптотических тельца (рис. 4 d ).

Иммунофлуоресцентное исследование тканей нечеловеческих приматов, инфицированных натуральной оспой. ( a ) Окрашивание на моноциты / макрофаги (зеленый) и вирусный антиген (красный) указывало на присутствие инфицированных моноцитов / макрофагов (золото) в лимфоидных тканях (показан лимфатический узел) и в кровотоке. ( b ) Помимо моноцитов / макрофагов, легко наблюдались инфицированные вирусом эндотелиальные клетки (зеленые). ( c ) Окрашивание на моноциты / макрофаги (зеленый) и апоптоз (красный) выявили присутствие многочисленных макрофагов, вызывающих покалывание, в лимфоидных тканях.Большинство апоптотических клеток были не моноцитами / макрофагами, а лимфоцитами. Показан редкий апоптотический моноцит / макрофаг (стрелка). ( d ) Моноцит / макрофаг с четко окрашенным неапоптотическим ядром (синий) показан поглощающим два отдельных апототических тельца.

В соответствии с геморрагическим диатезом, значения D-димера заметно увеличиваются в сыворотке инфицированных обезьян в корреляции с размером вирусного инокулята (рис.5 а ). Воспроизведение вируса натуральной оспы в тканях-мишенях почти наверняка привело к органной недостаточности по прямым и косвенным механизмам. Репликация вируса в макрофагах часто связана с инициированием цитокинового шторма, который, однажды начавшись, может каскадировать в серию событий, в значительной степени независимых от репликации вируса. Чтобы оценить возможные компоненты такого каскада, мы измерили значения цитокинов в сыворотке обезьян с помощью иммуноанализов, разработанных для обнаружения белков человека, но известных как перекрестные с белками макак.Резкое повышение уровня IL-8 наблюдалось у всех обследованных обезьян, инфицированных вирусом оспа (рис. 5 b ). ). Аналогичное увеличение наблюдалось для моноцитарного хемоаттрактантного белка 1, воспалительного белка макрофагов 1β, IFN-γ, IL-6 и IFN-γ (фиг.5 c-f ).

Концентрации димеров D, цитокинов и хемокинов, последовательно полученных от обезьян, инфицированных натуральной оспой. ( a ) D-димеры (мкг / мл) в сыворотках обезьян, которые получали дифференцированные дозы штамма натуральной оспы India 1724 i.v. ( b ) Концентрации IL-8 (пг / мл). ( c ) Концентрации хемоаттрактантного белка 1 моноцитов (пг / мл). ( d ) Концентрации воспалительного белка 1β в макрофагах (пг / мл). ( e ) Концентрации IL-6 (пг / мл) в сыворотках трех инфицированных обезьян i.v. со штаммом Harper (10 ⁹ БОЕ). ( f ) Средние (± 1 стандартное отклонение) концентрации IFN-γ (пг / мл) в сыворотке обезьян, инфицированных в / в. со штаммами India 7124 и Harper (10 ⁹ БОЕ).

Обсуждение

Демонстрация того, что штаммы вируса натуральной оспы могут вызывать смертельную болезнь у обезьян, является значительным шагом вперед в разработке противовирусных препаратов и улучшенных вакцин, а также в улучшении понимания патогенеза натуральной оспы.Результаты снизят угрозу повторного внедрения вируса оспы в иммунологически наивную популяцию людей. С дополнительным уточнением эта модель должна позволить продемонстрировать защитную эффективность таких контрмер в соответствии с правилом эффективности животных FDA (5). I.v. Инокуляция высоких доз вируса натуральной оспы вызвала тяжелое течение геморрагической болезни, заканчивающееся острой смертью, обычно в течение 6 дней после инокуляции. В идеале модель должна включать почти однородную смертность, но более длительное среднее время до смерти, при этом развитие болезни больше напоминает обычные формы оспы, чем геморрагический тип.Наши попытки достичь этой цели с помощью более низкой дозы в 10 раз привели к снижению смертности (ноль из трех и один из трех для штаммов Harper и India, соответственно). В настоящее время компромисс — снижение смертности в пользу уменьшения кровотечений. Снижение смертности коррелировало с дозозависимым снижением клинических признаков, включая количество поражений кожи и полости рта и титры вирусов, объективные параметры, которые могут быть приняты вместо данных о смертности в соответствии с правилом эффективности животных FDA.

Использование i.v. прививка вируса натуральной оспы эффективно затмевает инкубационную и продромальную фазы естественной инфекции натуральной оспы у людей, вызывая мгновенную виремию и системное распространение вируса в тканях-мишенях. Тем не менее, последовательность событий у обезьян похожа на геморрагическую оспу человека, форма которой почти всегда заканчивалась смертельным исходом (2). Использование этой модели для демонстрации эффективности противовирусных препаратов устанавливает высокую планку; Органы-мишени уже засеяны вирусом, тогда как при оспе человека эта эволюция происходит только через 10 или более дней после заражения (16).Таким образом, временное окно возможностей для эффективного вмешательства очень короткое. Усовершенствования модели, заслуживающие дальнейшего изучения, включают тестирование альтернативных путей воздействия с использованием штаммов Harper и India, включая инстилляцию через слизистую оболочку и интратрахеальную инстилляцию, хотя наши первоначальные исследования с использованием различных штаммов натуральной оспы в виде аэрозоля не увенчались успехом (9). Необходимы будущие испытания вирулентности натуральной оспы, выделенной от поздно умирающих обезьян (например, Monkey H-9), исходя из теории о том, что селективное давление могло усилить адаптированный к обезьянам штамм натуральной оспы из гетерогенного вирусного инокулята.Анализ вирусных клонов, выбранных из запасов вируса осповакцины, недавно выявил спектр фенотипов вирулентности (17). Адаптированный к обезьянам вирус натуральной оспы может вызывать системные инфекции более естественным путем и при более низких вирусных дозах.

Несмотря на свои ограничения, i.v. Описанная модель приматов натуральной оспы уже предоставила ценную информацию о патогенезе этого прекрасно адаптированного человеческого патогена. После i.v. инокуляция вируса натуральной оспы распространяется через моноцитарную клеточно-ассоциированную виремию, что приводит к поражениям лимфоидных тканей, кожи, слизистой оболочки полости рта, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы, почек и печени.Высокая вирусная нагрузка и связанные с ней дегенеративные изменения в тканях-мишенях способствуют дисфункции органов и мультисистемной недостаточности. Свидетельства активации каскада свертывания (D-димеры) и снижения количества тромбоцитов подтверждают гистологические доказательства геморрагического диатеза. Происходит истощение Т-клеточно-зависимых участков лимфоидной ткани, что, вероятно, является следствием сторонних апоптотических механизмов, инициированных инфицированными макрофагами (18).

Выработка цитокинов, включая IL-6, IL-8 и INF-γ, способствует цитокиновому шторму, ранее известному как «токсемия».Более точное понимание этих медиаторов должно обеспечить цели для терапевтического вмешательства, которое будет использоваться отдельно или в комбинации с ингибиторами репликации вируса натуральной оспы. Полногеномный анализ транскрипции хозяина у этих же обезьян выявил дополнительную информацию (18).

Вирусы натуральной оспы и оспы обезьян вызывают очень похожие заболевания у обезьян и напоминают оспу у людей, хотя и с ускоренным течением болезни. Путем параллельной разработки моделей приматов как натуральной оспы, так и оспы обезьян, мы ожидаем установить связи между ними, чтобы облегчить все, кроме наиболее важных испытаний возможных контрмер на модели обезьяньей оспы, как недавно сообщалось об альтернативной вакцине против оспы (модифицированная вакцина Анкара) ( 19).Модель приматов натуральной оспы будет зарезервирована для тестирования только тех контрмер, которые соответствуют всем другим требованиям FDA для лицензирования лекарств или вакцин.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лабораторий Drs. Ингер Дэймон, J.W.H., Луизу Питт, Шериф Заки и Том Ксиазек, а также отделы ветеринарной медицины Научно-исследовательского института инфекционных заболеваний армии США и Центры по контролю и профилактике заболеваний за их неоценимый вклад в эту работу.

Сноски

• ↵ † Кому следует направлять корреспонденцию: штаб-квартира, Исследовательский институт инфекционных болезней армии США, 1425 Porter Street, Frederick, MD 21702-5011.