Блок фбс 5 размеры: Купить ФБС 5 от Амега-Бетон в Уфе по низким ценам
ФБС 24-5-6 т по стандарту: ГОСТ 13579-78
увеличить изображение
Стандарт изготовления изделия: ГОСТ 13579-78
Фундаментные блоки сплошные ФБС 24-5-6 т – это надежная основа. Прочность, стойкость и долговечность – это лишь часть свойств, которым должна отвечать основа дома. Фундаментные блоки ФБС 24-5-6 т – «суровый» строительный материал, который представляет собой железобетонный краеугольный камень. Широкое применение этих элементов для строительства фундаментных конструкций не оставляет сомнений, что это действительно подходящий для этого материал. Может быть произведено строительство как жилых, так и производственных зданий.
1.Варианты написания маркировки.
Обозначение фундаментных блоков ФБС 24-5-6 т осуществляется согласно ГОСТ 13579-78 и включает две группы: буквенная – тип изделия, цифровая – размеры и класс по прочности.
1. ФБС 24-5-6 т т ;
2. ФБС 24-5-6 т п ;
3. ФБС 24-5-6 т ш ;
4. ФБС 24-5-6 т с ;
2.Основная сфера применения.
Блоки сплошного сечения ФБС 24-5-6 т используются для строительства сборных фундаментов для зданий различного назначения. Это могут быть как жилые дома, так и производственные строения. Блоки данного вида могут быть использованы и для дачного строительства, где заливка фундаментной конструкции не может быть произведена вручную. За счет особой формы этих железобетонных изделий строительство объекта сокращается по срокам вдвое.
Технология укладки блоков ФБС 24-5-6 т в качестве фундамента и стен подвального или технического подземного помещения полностью оправдывает себя на практике, как наиболее простая и быстровозводимая.
3.Обозначение маркировки изделий
Фундаментные блоки сплошного сечения ФБС 24-5-6 т маркируют согласно ГОСТ 13579-78. В группе обозначений указывают тип изделия, размерный ряд. Габаритные размеры блока составляют 2380х500х580 , где соответственно указаны длина, ширина и высота.
Рассмотрим обозначение ФБС 24-5-6 т
1. ФБС – фундаментный блок сплошной;
2. 24 – длина, указывается в дц.;
3. 5 – ширина, указывается в дц.
;
4. 6 – высота, указывается в дц.
Дополнительные данные для характеристики фундаментных блоков сплошного сечения:
1. Масса – 1630 ;
2. Геометрический объем изделия – 0,6902 ;
3. Объем бетона, расходуемый на один элемент – 0,68 ;
Маркировочные знаки, дата изготовления и вес изделий должны быть нанесены на торцевую грань несмываемой черной краской. Дополнительно может быть указан товарный знак компании-производителя.
4.Основные материалы для изготовления и характеристики.В качестве основного материала для изготовления блоков сплошного сечения ФБС 24-5-6 т используется пористый бетон. Это прочный и долговечный материал, который проявляет высокие свойства стойкости к действию различных сред. Пористая структура изделий обеспечивает их высокую теплопроводность.
Малый вес позволяет не обустраивать внушительное основание для фундамента. Высокая несущая способность (могут быть построены стены в 1,5 кирпича) значительно расширяет сферу использования фундаментных блоков сплошного сечения. Так как «работа» производится под действием постоянных сдавливающих и сжимающих деформаций, блоки должны быть армированы. Плотность должна соответствовать величине – не менее чем 1800 кг/м3. Марка по прочности на сжатие должна соответствовать пределам М100, допускается применять марки М50 и М200. Бетон должен также отвечать требованиям по водонепроницаемости и морозостойкости (температурный диапазон достигает до -70 градусов), так как эксплуатация осуществляется в достаточно жестких условиях. Не допускается к закладке в фундамент элементов с трещинами, наплывами, сколами и торчащими элементами арматурной сетки. Армируется в редких случаях, используется стальная углеродистая проволока класса А1 и А111. Подобные дефекты снижают несущую способность готового элемента и приводят к его быстрой негодности (под действием пучения грунтов и в условиях постоянного действия грунтовых вод).
5.Хранение и транспортировка.
Хранение блоков сплошных ФБС 24-5-6 т производится в штабелях. Послойно укладывают деревянные подкладки. Под штабель обустраивается щебенчато-песчаная подушка. Предпочтительна сортировка по видам и сортам изделий. Транспортирование железобетонных блоков для фундаментов производится посредством спецтранспорта с надежным закреплением каждого изделия. Не допускается перегрузка транспорта, обязательно учитывается грузоподъемность машины.
Уважаемые покупатели! Сайт носит информационный характер. Указанные на сайте информация не являются публичной офертой (ст.435 ГК РФ). Стоимость и наличие товара просьба уточнять в офисе продаж или по телефону 8 (800) 500-22-52
ФБС 24*5*6-Т: размеры, цены, характеристики.
Фундаментный блок сплошной
Технические характеристики
Производственный процесс основан на использовании бетонной массы с плотностью 1800-2400 кг на метр кубический.
Учитывая марки цементных составов, распределены классы прочности растворной массы блоков:
- М100 – от В7.5;
- М150 – минимум В12.5;
- М200 – В15.
Влагостойкость блоков – W2. Что же касается количества рабочих циклов («замораживание-оттаивание»), их должно быть более 50. Именно ГОСТы определили данный параметр устойчивости камней к воздействию отрицательных температур. Но ожидать чего-то сверхъестественного от железобетонных изделий в отношении теплопроводности, не имеет смысла.
Рабочие габариты блоков указаны в дециметрах, когда говорят о типе изделия. Допустимы округления в большую сторону. Также предусмотрена маркировка, чтобы понимать, какой тип бетона использован для изготовления ж/б продукции – Т (тяжелый), П (керамзитовый, основа пористая), С (силикатный).
Между цифрами маркировки, которые указывают на габариты блока, могут стоять точки, дефисы, звездочки или пробелы. Например, ФБС-24-6-6-Т или ФБС-24*6*6-Т. Но суть от этого не меняется.
По ГОСТу предусмотрены определенные требования относительно массы выпускаемых камней. Минимальный вес изделия – 260 кг. Но даже использование самых маленьких сплошных конструкций не обходится без привлечения строительной спецтехники. Наиболее ходовой и популярный товар – блоки 1960 кг.
Производственный процесс тщательно контролируется специалистами, чтобы продукция получалась геометрически одинаковой, с гладкой, плотной поверхностью. Любые отклонения станут причиной того, что гидроизоляция всей конструкции впоследствии будет нарушена, поверхность может потрескаться и быстро разрушиться.
Часто встречаются изделия под маркой Т меньшего веса. Это должно насторожить. Значит, на самом деле, использован другой бетон, например, керамзитовый, и маркировка должна быть другой. Либо же, внутри камня пустоты, поры из-за некачественного уплотнения, что отрицательно скажется на качестве готового объекта.
В ГОСТе указаны и допустимые максимальные погрешности (см) при изготовлении железобетонных изделий:
- длина – 1,3;
- ширина/высота – 0,8;
- вырез – 0,5.
Изготавливают продукт с металлическими петлями. Так гораздо удобней грузить и разгружать конструкции, перемещать по стройплощадке или складу. Есть варианты, у которых поверхность отделана специальными материалами, но это исключительные виды, стандарт – гладкая и плотная поверхность.
Стандартные размеры ФБС
Размерные параметры блочных камней также регламентированы государственными стандартами. Длина конструкций представлена в трех вариантах, мм: 2380, 1180, 880. Изменение ширины происходит с шагом 100 мм, диапазон, мм – 300-600. Что же касается высоты, здесь выбор наиболее ограничен, мм: 280, 580.
| Наименование продукции | Длина, мм | Ширина, мм | Высота, мм |
| ФБС-24*6*6-Т | 2380 | 60 | 580 |
| ФБС-24*5*6-Т | 2380 | 50 | 580 |
| ФБС-24*4*6-Т | 2380 | 40 | 580 |
| ФБС-24*3*6-Т | 2380 | 30 | 580 |
| ФБС-12*6*6-Т | 1180 | 600 | 580 |
| ФБС-12*5*6-Т | 1180 | 500 | 580 |
| ФБС-12*4*6-Т | 1180 | 400 | 580 |
| ФБС-12*3*6-Т | 1180 | 300 | 580 |
| ФБС-9*6*6-Т | 880 | 600 | 580 |
| ФБС-9*5*6-Т | 880 | 500 | 580 |
| ФБС-9*4*6-Т | 880 | 400 | 580 |
| ФБС-9*3*6-Т | 880 | 300 | 580 |
Сфера использования блоков
Подходят для организации:
- фундаментов;
- несущих стеновых конструкций;
- сооружений через реки и озера, ж/д переезды для авто и людей;
- наклонных спусков вместо лестниц;
- эстакад;
- оградительных сооружений;
- подпорных стенок.
Но первые две позиции в перечне – это первостепенные направления использования изделий.
Фундамент
Сплошные блоки используют для организации фундаментной основы ленточного типа, если позволяет грунт, в районах с благоприятными сейсмическими условиями. Желательно, чтобы были песчаные грунты, скальные. Если почвенный слой слабый приходится дополнительно делать армирующий пояс каждый раз после установки два ряда блоков. Иногда армопояс предусмотрен для всего дна котлована, пока не выведут первый блочный ряд, потом готовят песчаную подушку и укладывают сплошные блоки.
Прерывистую фундаментную основу возводят на слабопучинистых почвах. Меньше расходуется стройматериалов, соответственно, экономится бюджет. Между блоками выдерживают расстояние до 0,7 м. Затем заполняют пустоту грунтом, хорошо утрамбовывают. Несущая способность участка должна быть отличной.
На территории, где слабые грунты, также можно построить заданный объект, используя фундаментные блоки.
Железобетонные конструкции для первого ряда выбирают с подушкой, чтобы основание стало больше по площади. А потом уже укладывают обычные сплошные изделия. Есть и один важный секрет строительства фундаментных основ: чтобы прочность фундамента была максимальной, выбирают самые длинные блоки, уменьшая количество стыков.
Преимущества и недостатки материала
Зачастую не целесообразно делать монолитную основу, а выгодней воспользоваться возможностями сплошных блоков:
- строительство ведется быстрее – специалисты укладывают блоки по технологии без задержек, как в случае с ожиданием полного высыхания бетонного раствора;
- определены стандартные типоразмеры ж/б изделий, поэтому строители без проблем рассчитывают, сколько понадобится ФБС;
- экономия бюджета за счет отсутствия опалубочной системы, каркаса из арматурных элементов;
- заказчик только выбирает готовый продукт по заданным требованиям и габаритам;
- железобетонная продукция прослужит около ста лет;
- в процессе эксплуатации блочные элементы не деформируются;
- стены из блочных камней очень сложно механически повредить.
Есть у стройматериала и один солидный недостаток – большой вес. Работать с блоками без спецтехники невозможно. А это дополнительная статья расходов в общую смету по строительству. Иногда расходы действительно серьезные.
Стоимость фундаментных блоков
Некоторые строители причисляют к недостаткам и стоимость стройматериалов. Однако во многих случаях фундаментные блоки разрешают использовать повторно, вместо новых изделий, ведь они практически не разрушаются в эксплуатации. Степень разрушения легко устанавливает эксперт и тогда строители точно понимают, подходят неновые стройматериалы для строительства конкретного объекта или нет.
В любом случае, все изделия лучше приобретать у производителей, которые завоевали авторитет, пользуются хорошими рекомендациями, заказчики отзываются о них положительно. Важно приобрести качественную продукцию и достойно конкурировать на строительном рынке.
Руководство по выбору контрольных и блокирующих реагентов.
Экспериментальные протоколы с использованием иммунотехнологий часто можно улучшить за счет оптимального использования блокирующих реагентов, разбавителей и контролей.
Прочтите дополнительную информацию, чтобы узнать, как выбрать подходящие разбавители и этапы блокировки для предотвращения нежелательного фона, а также как экспериментальные элементы управления могут помочь определить источник нецелевого сигнала.Оптимизируйте свои экспериментальные протоколы с помощью контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов.
При разработке иммунотехнологии важно учитывать анализ результатов. Добавление правильных блокирующих реагентов и экспериментальных контролей может улучшить качество анализа и его интерпретацию. Включение положительных и отрицательных контролей важно при создании данных для публикации.
Используйте это руководство, чтобы узнать больше о выборе подходящих контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов в ряде иммунотехнологий для:
- Уменьшения фона
- Устранение неполадок с нецелевыми сигналами
- Облегчить анализ.
Проточная цитометрия
| Проблемы | Решение | Указанный продукт |
|---|---|---|
| Фон антител, связывающих Fc-рецепторы | Блокирует Fc-рецепторы. | Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела |
| Используйте вторичное антитело F(abʹ) 2 , чтобы избежать захвата Fc-рецепторами. | F(abʹ) 2 вторичные антитела | |
| Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью | Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. | Очищенные белки ChromPure™ |
| Подтверждение того, что вторичное антитело не влияет на нецелевой сигнал | Используйте изотипический отрицательный контроль (конъюгированный неспецифический IgG того же вида, что и вторичное антитело), чтобы продемонстрировать специфическое связывание вторичного антитела. | Очищенные белки ChromPure™ |
| Недостаток времени и отсутствие непосредственно конъюгированного первичного | Fab пометьте ваши первичные антитела перед инкубацией с образцом. | ФабуЛайт™ |
Вестерн-блоттинг
| Проблемы | Решение | Указанный продукт |
|---|---|---|
| Фон (неспецифический сигнал, перекрывающий интересующие полосы) | Используйте соответствующий блокирующий реагент, чтобы заблокировать мембрану перед инкубацией с первичным антителом. | Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина меченого антитела или БСА (5% вес./об.) (без IgG и без протеазы) |
| Избегайте использования молока или БСА, если используются первичные антитела, полученные от коз, лошадей или овец. Бычий IgG может взаимодействовать с антителом за счет гомологичных эпитопов близкородственных видов. | Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина меченого антитела | |
| Интерференция из-за сниженного количества иммунопреципитирующих (IP) антител при обнаружении белков 50 или 25 кДа | Чтобы избежать обнаружения тяжелых цепей IP-антител с молекулярной массой 50 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированными специфическими антителами против легких цепей. | Антитела против легких цепей |
| Чтобы избежать обнаружения легких цепей IP-антитела с молекулярной массой 25 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированным анти-IgG, Fc-фрагментом, специфичным после блокирования моновалентным Fab-фрагментом анти-Fc (FabuLight™). | Анти-Fc-специфические антитела Фрагменты Fab (FabuLight™) |
Чтобы подтвердить активность репортерного фермента, добавьте небольшой образец конъюгированного вторичного фермента непосредственно к субстрату и наблюдайте за ожидаемой реакцией. |
ИФА
| Проблемы | Решение | Указанный продукт |
|---|---|---|
| Фон | Используйте соответствующий объем блокирующего реагента, чтобы полностью заблокировать лунки перед инкубацией с первичным антителом. | Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина с меченым антителом или БСА (5% вес. /об.) (без IgG и без протеазы) |
| Нет сигнала | Используйте положительный контроль, чтобы продемонстрировать активность меченого вторичного антитела, покройте изотипом первичного антитела и непосредственно определите с помощью вторичного антитела | Очищенные белки ChromPure™ |
Меры предосторожности при блокировании бычьим сывороточным альбумином (БСА) или молоком:Бычий сывороточный альбумин (БСА) и сухое молоко иногда содержат бычий IgG. За исключением Bovine Anti-Goat IgG компании Jackson ImmunoResearch, многие вторичные антитела, такие как Anti-Bovine, Anti-Goat и Anti-Sheep, будут реагировать с бычьим IgG. Следовательно, использование БСА или сухого молока для блокирования или разбавления может значительно увеличить фон и/или снизить титр антител. Для блокировки используйте обычную сыворотку (5% об./об.) вида-хозяина меченого вторичного антитела. Дополнительная информация о БСА, не содержащем IgG и протеаз, от Jackson ImmunoResearch. |
IHC
| Проблемы | Решение | Указанный продукт |
|---|---|---|
| Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью | Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. | Протеины ChromPure™ |
| Фон (общий) | Блокирует эндогенные сайты связывания, которые могут взаимодействовать с экспериментальными реагентами. | Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела. |
| Развести антитела в буфере без белков-носителей. Отцентрифугировать рабочий раствор для удаления агрегатов. | Правильный разбавитель и подготовка, т.е. PBS/Твин 20 | |
| Фон (распознавание гомологичного Ig) | Используйте перекрестно-адсорбированные вторичные антитела с минимальной перекрестной реактивностью к анализируемым видам клеток или тканей. | Вторичные антитела Min X |
| Блокируют эндогенные иммуноглобулины. | Фрагменты Fab | |
| Множественное мечение первичных антител от одного и того же вида хозяина (например, мышь на мыши) | Используйте Fab-фрагменты в предлагаемых протоколах для выполнения множественной маркировки (см. онлайн). | Фрагменты Fab |
| Иммунологическая метка первичного антитела перед инкубацией. | ФабуЛайт™ | |
| Эндогенные ферменты | Инактивация эндогенных пероксидаз перекисью водорода. | Перекись водорода |
| Инактивация эндогенных фосфатаз левамизолом. | Левамизол | |
| Эндогенный биотин | Блокирует эндогенный биотин. | Инкубируйте со стрептавидином, а затем со свободным биотином. |
| Ионные или гидрофобные взаимодействия | Включите моющее средство в буферы, оптимизируйте концентрацию соли и pH. | Твин 20 и/или Тритон Х-100 |
Иммунореагенты
Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр иммунореагентов, предназначенных для повышения эффективности и простоты анализа. Приведенные ниже иммунореагенты выделены в этом руководстве. Посетите наш веб-сайт или ознакомьтесь с нашим каталогом для получения дополнительной информации о широком ассортименте вторичных антител и конъюгатов, производимых компанией Jackson ImmunoResearch.
- Нормальные сыворотки
- Очищенные белки ChromPure™ из нормальных сывороток
- Моновалентные Fab-фрагменты аффинно-очищенных антител
- Бычий сывороточный альбумин, не содержащий IgG и протеазы
Если вам требуется дополнительная поддержка при выборе антител или у вас возникли проблемы с экспериментом, свяжитесь с нашей технической командой по адресу [email protected]. |
Нормальные сыворотки
Нормальные сыворотки получают от неиммунизированных животных и, следовательно, не обнаруживают какой-либо специфический антиген.
Обычная сыворотка, разбавленная до 5% (об./об.) в PBS (или аналогичном буфере), настоятельно рекомендуется в качестве блокирующего агента для снижения фона от неспецифического связывания с консервативной последовательностью и/или Fc-рецептором. Наилучшие результаты получаются с разбавленной нормальной сывороткой того же хозяина, что и меченое антитело, используемой в качестве отдельного этапа инкубации перед добавлением первичного антитела.
Обзор нормальных сывороток
ChromPure™ Очищенные белки из нормальных сывороток
Белки ChromPure™ в основном используются в качестве экспериментальных контролей для первичных или вторичных антител. Их также можно использовать в качестве блокирующих реагентов для Вестерн-блоттинга, IHC и IF. Белки ChromPure™ получают из сыворотки неиммунизированных животных и не распознают какие-либо известные антигены. Их готовят с использованием различных хроматографических методов, чтобы получить материал без загрязняющих молекул вплоть до концентрации 20 мг/мл, что делает их идеальными для использования в качестве экспериментальных контролей для наиболее чувствительных анализов.
Белки ChromPure™ доступны в различных форматов для многих видов, включая цельный иммуноглобулин, F(ab’) 2 и Fab-фрагменты.
Также доступны человеческий IgM, сывороточный IgA и другие белки. Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр конъюгатов для этой линейки продуктов, в том числе ряд флуоресцентных красителей и репортерных ферментов, позволяющих изолировать сигнал, полученный в результате неспецифических взаимодействий.
Обзор ChromPure™ Purified Proteins
Моновалентные Fab-фрагменты
Affinity-Purified AntibodiesFab-фрагменты можно использовать для блокирования эндогенных иммуноглобулинов с целью уменьшения фонового окрашивания и двойного мечения первичных антител одного и того же вида-хозяина. В следующем примере показано, как можно использовать Fab-фрагменты для блокирования эндогенных иммуноглобулинов при использовании мышиных первичных антител на ткани мыши.
Просмотреть моновалентные Fab-фрагменты
Бычий сывороточный альбумин, не содержащий IgG и протеаз
Бычий сывороточный альбумин (БСА) широко используется в качестве белка-носителя для разбавления антител и в качестве общего блокатора белка в иммуноанализах и протоколах иммунодетекции.
Если BSA является желательным разбавителем или блокирующим реагентом для вашего анализа, важно использовать BSA, подходящий для этой цели.
Большинство продуктов BSA, в том числе те, которые продаются как не содержащие обнаруживаемых IgG, загрязнены низкими уровнями бычьего IgG.
IgG крупного рогатого скота имеет много общих эпитопов с IgG козы, овцы и лошади и может стать мишенью для вторичных антител, направленных против этих видов (исключением является бычий IgG против коз). Это может произойти и с другими антителами, которые перекрестно реагируют с бычьим IgG. Взаимодействие может привести к потере активности антител и/или увеличению фона. Фон может возникать из-за липких, растворимых иммунных комплексов или из-за неспецифического связывания контаминирующего бычьего IgG, привлекающего перекрестно реагирующие меченые вторичные антитела.
Бычий сывороточный альбумин Jackson ImmunoResearch не содержит IgG и протеазы. Он не содержит загрязняющих IgG, что устраняет общие проблемы иммуноанализа, связанные со многими коммерческими препаратами БСА высокой чистоты.
БСА без IgG поставляется в виде чистого белка, высушенного вымораживанием из деионизированной воды, в упаковках по 10 г, 50 г и 250 г.
Просмотр Бычий сывороточный альбумин
Ссылки :
- Alberts B et al (1994) Molecular biology of the Cell. 3-е изд. Гирлянда Пресс. Лондон.
- Калюжный А. (2016) Иммуногистохимия – основные элементы и не только. Springer International Publishing Швейцария.
- Манн, М. и Дженсен, О.Н. (2003) Протеомный анализ посттрансляционных модификаций. Нац. Биотехнолог. 21, 255-261.
| Подробнее: | Сделайте больше: |
|---|---|
| Множественное мечение с использованием вторичных антител | Цельные аффинно-очищенные антитела IgG |
| Прямой и непрямой вестерн-блоттинг | Вторичные антитела, специфичные к легкой цепи |
| Выбор вторичного антитела | Вторичные антитела для обнаружения VHH |
Блокирующие буферы для Вестерн-блоттинга и ИФА | Thermo Fisher Scientific
Перед использованием антител для обнаружения белков, которые были нанесены точками или перенесены на мембрану, необходимо заблокировать оставшуюся связывающую поверхность, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител.
В противном случае антитела или другие реагенты для детекции будут связываться с любыми оставшимися сайтами, которые изначально служили для иммобилизации представляющих интерес белков. В принципе, для блокирования можно использовать любой белок, который не обладает аффинностью связывания с целевым белком или компонентами зонда (антителами) в анализе. На практике, однако, некоторые белки работают лучше, чем другие, потому что они более последовательно связываются с мембраной или другой поверхностью иммобилизации или потому что они стабилизируют функцию других компонентов системы.
Исследовать: блокирующие буферы вестерн-блоттинга Протоколы вестерн-блоттинга
Содержание страницы
- Назначение и функция шагов блокировки
- Типы буферов блокировки
- Какой буфер блокировки использовать?
Назначение и функция блокирующих ступеней
Мембранные носители, такие как нитроцеллюлоза и поливинилидендифторид (ПВДФ), используемые в вестерн-блоттинге, обладают высоким сродством к белкам.
Чтобы предотвратить неспецифическое связывание детектирующих антител на этапах после переноса, незанятые участки на поверхности мембраны должны быть заблокированы. Составы блокирующих буферов сильно различаются и могут содержать молоко, обычную сыворотку или высокоочищенные белки для блокирования свободных участков мембраны. Этап блокировки является обязательным и улучшает отношение сигнал-шум анализа за счет уменьшения фоновых помех. Недостаточное количество блокиратора приводит к чрезмерному фоновому шуму и снижению отношения сигнал/шум; напротив, чрезмерные концентрации блокатора могут маскировать взаимодействия антитело-антиген или ингибировать фермент-маркер, что вызывает снижение сигнала-мишени.
Типы блокирующих буферов
В вестерн-блоттинге успешно используются несколько типов блокирующих буферов. Большинство блокирующих буферов для вестерн-блоттинга представляют собой инертные растворы либо смешанных белков, либо одного очищенного белка, которые в идеале практически не взаимодействуют с определяющими антителами или антигенами на блоте.
Как правило, блокирующие агенты разводят либо в солевом растворе с трис-буфером (TBS), либо в фосфатно-солевом буфере (PBS) с детергентом или без него. Детергенты, такие как Tween-20, могут быть добавлены в блокирующий буфер для дальнейшего снижения неспецифического связывания. Количество Tween-20 (0,05%-0,2%) будет варьироваться в зависимости от силы используемых антител. Слабосвязывающиеся антитела могут быть смыты слишком большим количеством моющего средства при последующих промывках.
| Blocking Buffer/Agent | Benefits | Considerations |
|---|---|---|
| 2-5% Non-fat milk | Inexpensive, contains multiple types of proteins | Contains biotin and phosphoproteins, which can interfere with streptavidin-biotin стратегии обнаружения и обнаружения фосфорилированных белков-мишеней. Из-за большого количества белков в молоке молоко может маскировать некоторые антигены и снижать предел обнаружения вестерн-блоттинга. |
| 2-3% бычий сывороточный альбумин (БСА) | Хорошая альтернатива молоку, может использоваться в биотин-стрептавидиновых системах или при поиске фосфопротеинов | В продаже имеются различные сорта БСА, которые могут влиять на отношение сигнал/шум . BSA, как правило, является более слабым блокатором, что может привести к более неспецифическому связыванию антител, но может увеличить чувствительность обнаружения белков с низким содержанием. |
| Очищенные белки (например, казеин) | Буферы, блокирующие отдельные белки, могут обеспечить меньшую вероятность перекрестной реакции с компонентами анализа, чем растворы сыворотки или молока. Идеально, когда блокаторы, такие как обезжиренное молоко, блокируют связывание антиген-антитело | Дороже, чем традиционные рецептуры обезжиренного молока. |
Какой блокирующий буфер использовать?
Выбор блокирующего буфера для вестерн-блоттинга часто зависит от системы. Определение правильного блокирующего буфера может помочь увеличить отношение сигнал/шум в системе. Иногда при переключении с одного субстрата на другой может потребоваться изменение блокирующего буфера, чтобы избежать проблем со снижением сигнала или усилением фона.
Например, при применении конъюгата щелочной фосфатазы (ЩФ) следует выбирать блокирующий буфер в трис-буферном солевом растворе (ТБС), поскольку фосфатно-солевой буфер (ФСБ) препятствует активности ЩФ. Эмпирическое тестирование различных блокирующих буферов для использования с данной системой может помочь в достижении наилучших возможных результатов. Ни один блокирующий агент не подходит для любого применения, поскольку каждая пара антитело-антиген имеет уникальные характеристики.
Прилагаемые рисунки иллюстрируют ценность тестирования различных блокирующих буферов в рамках оптимизации вестерн-блоттинга. В этих примерах экспериментов, в которых все остальные условия были одинаковыми, различные блокирующие буферы подавляли или повышали чувствительность и специфичность вестерн-блоттинга для отдельных белков. В других случаях слабые блокирующие буферы могут вызывать появление неспецифических полос.
Нажмите на изображение, чтобы увеличить его
Сравнение 2% BSA, 5% NF-Milk и блокирующего буфера StartingBlock при обнаружении pAKT.
Метод. Серию разведений лизата клеток 293T, начиная с 10 мкг/лунку, наносили на гели Bolt 4–12% Bis-Tris-Plus и подвергали электрофорезу при 200 В в течение ~20 мин. Гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью устройства для переноса геля iBlot 2 (протокол P0 в течение 7 мин). Иммуноблотинг обрабатывали с использованием автоматизированного процессора вестерн-блоттинга Bandmate. Мембраны блокировали либо 2% BSA (PBS), 5% обезжиренным молоком (PBS), либо блокирующим буфером StartingBlock. Мембраны исследовали с помощью Rabbit Anti-pAKT (1:1000, № по каталогу MA5-149).16) разводят соответствующим блокирующим буфером. За этим последовала инкубация с HRP-конъюгированным козьим антикроличьим IgG (1:2500 или 0,04 мкг/мл, № по каталогу 32460). Детекцию хемилюминесценции проводили с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico PLUS. Мембраны визуализировали в системе визуализации iBright.
При обнаружении pAKT в лизатах клеток 293T 2% BSA и блокирующий буфер StartingBlock обеспечили самую высокую чувствительность.
Однако 2% БСА слабо блокировал неспецифическое связывание детектирующих антител, что видно по неспецифическим образцам полос при более высокой общей нагрузке лизатом. 5% NF-Milk обеспечивает самый низкий фон, но цена достигает предела обнаружения.
Нажмите на изображение, чтобы увеличить мин. Гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью устройства для переноса геля iBlot 2 (протокол P0 в течение 7 мин). Иммуноблотинг обрабатывали с использованием автоматизированного процессора вестерн-блоттинга Bandmate. Мембраны блокировали 5% BSA (PBS), 5% обезжиренного молока (PBS), 1% казеина (PBS) или блокирующим буфером StartingBlock. Мембраны исследовали с помощью Rabbit Anti-Hsp9.0 (1:5000, № по каталогу MA1-10372), разбавленным соответствующим блокирующим буфером. За этим последовала инкубация с HRP-конъюгированным козьим антикроличьим IgG (1:1000 или 0,01 мкг/мл, кат. № 32460). Детекцию хемилюминесценции проводили с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico PLUS.
Мембраны визуализировали в системе визуализации iBright.
При обнаружении Hsp90 в большом количестве в лизатах клеток 293T все протестированные блокирующие буферы обеспечивали приемлемые отношения сигнал/шум. 5% БСА демонстрировал более высокий уровень неспецифического связывания с антителами для обнаружения, но обеспечивал хорошую чувствительность.
Рекомендации по флуоресцентному вестерн-блоттингу
Частицы и загрязнители в блокирующих и промывочных буферах могут оседать на мембранах и создавать флуоресцентные артефакты, поэтому при флуоресцентном вестерн-блоттинге важно использовать высококачественные отфильтрованные буферы. Кроме того, ограничьте использование детергентов на этапах блокировки, так как обычные детергенты могут самофлуоресцировать, что может привести к увеличению неспецифического фона.
Нажмите, чтобы увеличить изображение
Метод: Серию разведений клеточного лизата A431, начиная с 15 мкг/лунку, наносили на гели Bolt 4–12% Bis-Tris-Plus и подвергали электрофорезу при 200 В в течение ~20 мин.
Гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью устройства для переноса геля iBlot 2 (протокол P0 в течение 7 мин). Мембраны блокировали блокирующим буфером Blocker FL, 5% обезжиренным молоком (TBS) или другим специальным блокирующим буфером. Мембраны исследовали анти-EGFR, анти-Stat3 или анти-Ras10, разведенными в соответствующем блокирующем буфере. За этим последовала инкубация с конъюгированным с Alexa Fluor Plus 800 козьим антикроличьим IgG и Alexa Fluor Plus 680 козьим антимышиным IgG. Мембраны визуализировали в системе визуализации iBright.
Рекомендуемые Thermo Scientific блокирующие буферы для вестерн-блоттинга
| Select when | Thermo Scientific product | Blocking agent | Highlights | When to use | Available formats | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Chemiluminescent western blotting | ||||||||||
| Optimizing a new western blot system | Блокирующий буфер StartingBlock | Отдельный очищенный белок, не содержащий сыворотки и биотина |
| PBS TBS PBST TBST | ||||||
| Традиционные блокаторы не обеспечивают достаточной чувствительности | Блокирующий казеин | Очищенный казеин |
| Ориентация на белки с высоким содержанием меди или использование антител с высокой аффинностью PBS | ||||||
| Нацеливание фосфопротеинов или нуждающихся в наибольшей степени чувствительности | Блокер BSA | Очищенные BSA |
| |||||||
| Fluorescent western blotting | ||||||||||
| Performing fluorescent western detection | Blocker FL Fluorescent Blocking Buffer (10x) | Single purified protein |
| Визуализация и хранение сухих флуоресцентных блотов | 10-кратный концентрат | |||||
реакция с компонентами анализа, чем растворы сыворотки или молокаДополнительные доступные блокирующие буферы
| Блокирующий агент | ОЧЕНЬ | При использовании | . Когда используется | . | Борат, pH 7,6 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Блокирующий буфер для рыбьей сыворотки | Сыворотка стального лосося |
|
| PBS | ||||
| SuperBlock Blocking Buffer | Очищенный гликопротеин без сыворотки и биотина |
|
| PBS TBS PBST TBST | ||||
| Blocker BLOTTO | Молоко сухое обезжиренное |
|
| TBS | ||||
| Блокирующий буфер, не содержащий белков | Соединение, не блокирующее белки |
| PBS TBS PBST TBST | |||||
| Pierce Fast Blocking Buffer | Single purified protein |
|
| TBS |
Рекомендуемое чтение
- Ден Холландер, Н.
